斑马鱼wbp11基因敲除品系的建立.pdf

激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.3June.2023第 32 卷第 3 期2023 年 6 月收稿日期：2023-03-13；修回日期：2023-05-16。基金项目：广东省人民医院院内博士后进站启动项目（BY01202204）；湖南省研究生科研创新项目（CX20210479）；国家自然科学基金面上项目（31872315）；国家重点研发计划项目（2018YFA0108700，2017YFA0105602）；国家自然科学基金重点国际（地区）合作与交流项目（81720108004）。作者简介：游诗琦，硕士研究生。*通信作者：李永青，教授，主要从事心脏发育和疾病的分子机制的研究。E-mail:。斑马鱼wbp11基因敲除品系的建立游诗琦1，陈宇2，3，杨雪婷1，李韵璇1，乔卿1，罗莹1 姚梅英1，高罗晴1，刘欣1，王跃群1，吴秀山1，3，李永青1（1.湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，心脏发育研究中心，长沙 410081；2.广东省心血管病研究所，广东省人民医院，广州 510100；3.广东省心脏病发病机制与精准防治重点实验室，广州 510100）摘要：WBP11是WW结构域结合蛋白家族的一员，参与前体mRNA剪接过程，是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一，其基因组中含有人类WBP11的同源基因wbp11。为了研究WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制，利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼wbp11基因敲除品系。首先，在wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点，体外转录合成sgRNA，通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除，得到F0代嵌合体斑马鱼。随后，将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，所得到的F1代斑马鱼进行基因型鉴定，筛选出其中的杂合子斑马鱼，并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序，结果显示其为wbp11基因的2种缺失突变。让同种突变的F1代杂合子斑马鱼自交，对得到的后代F2进行基因型鉴定，筛选获得了纯合子斑马鱼，表明wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现，受精后48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形，这可能是由于wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路。关键词：斑马鱼；wbp11；CRISPR/Cas9；基因敲除；杂合子中图分类号：Q341；Q812 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.004Construction of Zebrafish wbp11 Gene Knockout LineYOU Shiqi1,CHEN Yu2,3,YANG Xueting1,LI Yunxuan1,QIAO Qing1,LUO Ying1,YAO Meiying1,GAO Luoqing1,LIU Xin1,WANG Yuequn1,WU Xiushan1,3,LI Yongqing1(1.The Center for Heart Development,State Key Laboratory of Freshwater Fish Development Biology,Hunan Normal University,Changsha 410081,China;2.Guangdong Cardiovascular Institute,Guangdong Provincial Peoples Hospital,Guangdong Academy of Medical Sciences,Guangzhou 510100,China;3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis,Targeted Prevention and Treatment of Heart Disease,Guangzhou 510100,China)Abstract:As a member of the WW domain binding protein family,WBP11 is an important splicing factor involved in the pre-mRNA splicing process.Zebrafish,one of the notable model organisms,contains orthological homologous gene wbp11 in its genome.In order to study the mechanism of WBP11 in the early development in vertebrates,a knockout strain of wbp11 in ze-brafish was constructed using CRISPR/Cas9 technology.Firstly,gene knockout target sites were designed on the second exon 激光生物学报218第 32 卷WW结构域又被称为Rsp5或 WWP domain，是由3040个氨基酸所组成的结构紧密的三股反平行折板结构域1。WW结构域具有特异专一性，能够与富含脯氨酸序列（XPPXY）的蛋白质分子（P：脯氨酸，Y：酪氨酸，X：任意氨基酸）作用，广泛存在于真核生物中，在蛋白质降解、转录和RNA剪接等多种细胞功能的调控中发挥重要作用2。而WW结构域结合蛋白家族，顾名思义，它们识别并结合含有WW结构域的蛋白质。其家族成员WW结构域结合蛋白11（WW domain binding protein 11，WBP11），参与前体mRNA剪接过程3。真核生物mRNA成熟前需要在细胞核中经过前体mRNA的剪接加工过程，即前体mRNA在剪接复合体的作用下，通过精确识别移除内含子并把外显子进行拼接而得到成熟的mRNA，成熟mRNA再转运出细胞核在核糖体被翻译成蛋白质4。基因的剪接是重要的转录后调控，对于基因的差异表达、组织器官的发育调控以及正常功能的维持具有重要的生理意义5-7。WBP11与 E3泛素连接酶PRP19（pre-mRNA processing factor 19）剪接体复合物相关，并共定位于富含剪接因子的核斑点8-10。该复合物是一种动态剪接核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合物，负责去除非编码片段、外显子连接（编码片段）和调节前体mRNA的可变剪接11-13。目前对于WBP11基因的功能研究非常少。已有研究显示，在人类和小鼠中，WBP11基因突变会导致人类出现多种先天性异常，包括先天性心脏病、椎体异常、食道异常、肾脏异常等，该基因突变的小鼠也表现出类似的先天性异常，但未发现有心脏畸形14。对于WBP11基因在其中的作用机制还未有研究，也不清楚WBP11突变体在心脏发育中的不同表现是由于物种差异还是其他原因所致。而作为重要模式生物的斑马鱼wbp11基因是人类和小鼠WBP11基因的直系同源基因，因此，我们首次使用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼的wbp11基因进行特异性敲除，以获得wbp11基因缺陷的突变体斑马鱼，从而为进一步探究wbp11基因突变对斑马鱼早期的生长发育所造成的影响以及其生物学功能奠定基础。1材料与方法1.1试验材料本试验使用的AB品系野生型斑马鱼（Bar-chydanio rerio var）由本实验室繁殖饲养，水温约28.5，采取14 h光照/10 h黑暗光周期，pH值维持在6.87.5。斑马鱼胚胎置于E3 Buffer，在28.5恒温培养箱中孵育，46 d开始喂食草履虫（Par-amoecium caudatum），12 d开始草履虫和丰年虾（Artemia salina）混合喂养，15 d转移到养殖系统中，直至3个月性成熟，成鱼早中晚各喂食1次。研究所用仪器与试剂：多聚酶链式反应仪，移液器和分光光度计（Eppendorf公司）；斑马鱼养殖系统（北京爱生科技发展有限公司）；离心机（Fresco生物）；凝胶成像分析系统（Tanon公司）；恒温培养摇床（HZQ-A）（江苏太仓仪器设备）；表型分析多倍显微镜（奥林巴斯公司）；倒置荧光体视镜（蔡司公司）；拉针仪（narishige）；pH计（320-S）（Barnstead）；显微注射仪（PLI-100A）（Harvard Apparatus）；精度分析天平（舜宇恒平）；DEPC水（0.1%DEPC溶于去离子水中）；E3 Buffer（5 mol/L NaCl溶液60 mL，1 mol/L KCl溶液10 mL，1 mol/L MgSO4 20 mL，CaCl2 2.94 g，甲基蓝精粉1.00 g，去离子水定容至600 mL）；LBof wbp11 gene,and sgRNA was synthesized by transcription in vitro.After microinjection technology,F0 generation chimeric zebrafish with wbp11-knockout was obtained.Then,the F1 generation zebrafish by crossing chimeric zebrafish with wild-type zebrafish were identified by genotype,and heterozygous zebrafish were screened out.The sequencing results for exact bands of heterozygous zebrafish showed that there were two strains with different sequence deletion.Heterozygous zebrafish of the F1 generation of the same strain were self-crossed.The homozygous zebrafish was screened out via genotyping,meaning the wbp11 gene knockout strain was successfully constructed.The zebrafish with 48 hours post fertilization showed pericardial edema,heart linearization and skeletal curvature obversed by microscopic white light imaging.These defections may be resulted from the abnormal splicing mechanism caused by the deletion of wbp11 gene.This study opens the way to explore the mecha-nism of WBP11 gene in the early development in vertebrates.Key words:zebrafish;wbp11;CRISPR/Cas9;gene knockout;heterozygote （Acta Laser Biology Sinica,2023,32(3):217-225）219第 3 期扩增模板，构建50 L的PCR体系（其中2buffer 25 L，sgRNA-F/sgRNA-R均2 L，线性化的p42250模板2 L，dNTP各1 L，ddH2O补齐至50 L）进行扩增，依照Rapid Taq Master Mix设置常规PCR程序，退火温度为60，