薄膜过滤法在抗生素类注射剂无菌检查中常见问题及分析.pdf

第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.9 No.4Aug.2023文章编号：2096-0387（2023）04-03薄膜过滤法在抗生素类注射剂无菌检查中 常见问题及分析简秋瑜1，袁海梅2（1.云南省食品药品审核查验中心，云南昆明 650000；2.楚雄州检验检测认证院,云南楚雄 675000）摘 要：抗生素类注射剂为无菌制剂，按 2020 年版 中华人民共和国药典 的规定，必须对其进行无菌检查且符合 2020 年版 中华人民共和国药典 无菌制剂项下的相关规定。本文针对薄膜过滤法在抗生素类注射剂进行无菌检查过程中遇到的常见问题进行分析整理，为相关从业人员提供借鉴。关键词：薄膜过滤法；抗生素类注射剂；常见问题中图分类号：R944.1 文献标识码：CCommonProblemsandAnalysisofMembraneFiltrationMethodinSterilityInspectionofAntibioticInjectionJIAN Qiuyu1,YUAN Haimei2(1.Yunnan Provincial Food and Drug Audit and Inspection Center,Kunming,650000,China;2.Chuxiong Prefecture Inspection,Testing and Certification Institute,Chuxiong 675000,China)Abstract:Antibiotic injections are sterile preparations.According to the provisions of the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China(2020),they must undergo sterility tests and comply with the relevant provisions under the sterile preparations of the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China(2020).This paper analyzes and sorts out the common problems encountered in the sterility inspection of antibiotic injections by membrane filtration method,and provides reference for relevant practitioners.Keywords:membrane filtration;antibiotic injection;common problem抗生素类注射剂在一定程度上可抑制微生物生长和繁殖，但在用常规方法对其进行无菌检查时容易出现假阴性结果。按照 2020 年版 中华人民共和国药典 规定1，只要供试品性状允许，包括能直接过滤或者经过处理后能过滤的供试品，应采用薄膜过滤法进行无菌检查。选用薄膜过滤法检测抗生素类注射剂，可将药物抗微生物物质去除，细菌等其他微生物则会遗留在过滤器，对其培养促使生长和繁殖，以此定性或定量检测微生物2。由于不同类别抗生素类注射剂的抗菌活性、抗菌谱不同，在对抗生素类注射剂用薄膜过滤法消除其抑菌作用而进行无菌检查的过程中，笔者通过多年从事的微生物检验工作经验，归纳总结容易遇到的问题，为相关从业人员提供借鉴。1 常见问题及分析1.1 供试品溶解不彻底抗生素类固体注射剂（如密封瓶粉针剂）无菌检查时需要溶解、转移、稀释后再采用薄膜过滤法过滤，在溶解稀释的过程中，溶剂和稀释液的种类、比例和振荡器的使用等因素都会直接影响到供试品的溶解过滤效果。2020 年版 中华人民共和国药典 四部无菌检查法中收载的稀释液有0.1%无菌蛋白胨水溶液、pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%的无菌氯化钠溶液，试验研究结果表明，用前两种溶液做稀释剂，其微生物的回收率远高于 0.9%的无菌氯化钠溶作者简介：简秋瑜（1981），女，云南通海人，本科，主管药师，研究方向为药品微生物。第 4 期113简秋瑜等：薄膜过滤法在抗生素类注射剂无菌检查中常见问题及分析液3。此外，笔者在注射用派啦西林钠他唑巴坦钠无菌检查工作中，按索要到的方法进行无菌检查，发现阳性对照菌在规定条件下未能生长，无菌试验结果无效。经原因排查，证实是供试液溶解不彻底，过滤时滤膜吸附了大量供试品，被滤膜吸附的供试品虽经反复冲洗仍不能去除干净，残留在滤膜上的供试品导致阳性菌不能在规定的条件下生长。后从厂家了解到，检验人员在对注射用派啦西林钠他唑巴坦钠进行无菌检查时，使用了促进供试品溶解的振荡仪，但在所提供的无菌检查方法中并未记录振荡操作的相关信息，从而导致监督抽检中无菌检查项目实验不成立。1.2 集菌培养器选择不当为了避免操作过程带来的人为污染和人为偏差，大部分实验室会优先选择用一次性全封闭集菌培养器对抗生素类注射剂的供试品溶液进行过滤。全封闭集菌培养器的滤膜材质、孔径及其与检品的相容性是影响试验结果的关键因素。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分截留效果，即抗生素类注射剂具有抑菌性，在过滤时易被滤膜吸附，须采用疏水性边缘及低吸附的滤膜，如可选用尼龙膜材质的集菌器。无菌检查用的薄膜过滤器的滤膜孔径应不大于 0.45 m，该孔径滤膜能有效截留微生物，滤膜直径为 50 mm3。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损。目前市面上销售的一次性全封闭集菌培养器的品牌、型号、规格众多，适用的产品类型也不相同。如A 企业生产的集菌培养器：安瓿瓶装抑菌性药液可选用加长型取样针，无需将样品额外转移，可快速转移检品；西林瓶装抑菌性粉剂可选用双针座设计，提供全封闭溶解方案，实现溶解、过滤、冲洗一体化操作，避免转移操作；需稀释的西林瓶装抑菌性粉剂可选用三针座设计，溶解、稀释、过滤、冲洗一体化操作，降低抑菌成分浓度，减少吸附。检验人员在选择集菌培养器时，要结合产品溶解度、抑菌程度等以达到预期的过滤效果，选择不当会增加冲洗液的用量并影响检验结果的可靠性。1.3 冲洗方法不具体抗生素类注射剂中有的品种抑菌作用较强，供试液过滤后还需要通过冲洗液冲洗才能消除其抑菌作用。笔者在长期抗生素类注射剂无菌检查工作中发现，索要到的一些无菌方法验证报告中试验操作过程过于简单，只是列出冲洗量和冲洗次数，冲洗量得出的过程并没有详细记录，也没有注明冲洗时的流速。如克林霉素注射液无菌检查方法验证结果报告中记录的冲洗操作方法和实际操作中使用的方法不完全一致（表 1）。从表 1 中可以看出，方法验证报告中冲洗方法描述比较简单，许多需要注意的操作细节在方法验证报告中并没有记录。且在大部分验证报告中冲洗时的流速均没有注明，而流速过快或过慢都会对实验结果造成一定的影响，如过慢的冲洗流速不能把抑菌成分冲洗干净，消除不了供试品的抑菌作用，而过快的冲洗流速会损伤微生物，从而导致检验结果不能反映供试品真实的无菌状态4。1.4 培养基储存不当对于适用性检查合格的培养基，储存不当会导致质量降低甚至不合格，影响无菌试验的结果。如无菌检查中最常用的硫乙醇酸盐流体培养基，可以在普通有氧环境下提供厌氧条件，使需氧菌和厌氧菌都能够生长良好，并易于观察结果5。2020 年版 中华人民共和国药典 四部规定，在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的 1/3，培养结束后，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的 1/2。对培养基有要求，是为了确保培养基的厌氧层能够满足厌氧菌生长条件的需要6。培养基氧化层的高度多少，取决于培养基的储存条件。不同的实验室对配制好的无菌检查用培养基会有不同的储存方式，如有的实验表 1 克林霉素注射液方法验证报告中的冲洗方法和实际试验冲洗方法对比方法来源方法步骤验证报告供试液全量用全封闭集菌器过滤后，每膜用不少于 500 mL 的 0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，每次 100 mL 并振摇实际操作取适量的 0.1%无菌蛋白胨水溶液润湿滤膜，同时保留一定高度的水溶液在滤筒中，以防供试液和滤膜直接接触。然后，用全封闭薄膜过滤器全量过滤，过滤过程中液面保持在 50 mL 左右。全量过滤后，每个膜用 500 mL 的 0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，每次 100 mL，振摇时需等滤液下降到 80 mL 左右开始一边过滤一边振摇，力度均匀，等套筒中剩下 20 mL 左右的冲洗液后停止振摇，滤后，重复操作，直至冲洗完114生物化工2023 年室用量较大，大批量配制后采用无菌灌装，并在容器内填充氮气，压盖，2 25 储存；有的实验室用量不大，可用硅胶塞及纱布包裹瓶口灭菌后，2 8 避光保存。无论采用什么条件储存，都应该进行相关的验证，以确定合理的保存条件，保证培养基的质量符合要求。1.5 酶的活性降低在抗生素类注射剂无菌检查中，除了采用薄膜过滤法消除其抑菌作用外，针对一些抗菌作用比较强的-内酰胺类抗生素类注射剂，还可以加入中和剂-内酰胺酶，两种方法联合使用可有效消除供试品的抑菌活性。供试品过滤、冲洗完成后，在加入培养基的集菌器中加入中和剂-内酰胺酶，使通过冲洗不能完全冲洗干净、吸附于滤膜的少量供试品失去活性。-内酰胺酶的使用，可以减少冲洗液的冲洗总量和冲洗次数，避免滤膜上的微生物受损坏。-内酰胺酶的储存条件为 2 8，储存温度的不同，酶的活力也会受到不同影响。实验室在使用此类酶的过程中，要严格按照产品的要求储存，注意储存温度和储存时间对酶活性的影响。储存不当，酶的活性降低，若始终按标示的酶活性计算加入的量，加入的酶无法彻底消除供试品的抗菌 作用。1.6 阳性对照菌未按要求加入规定量2020 年版 中华人民共和国药典 规定应根据供试品的特性选择阳性对照菌，阳性对照实验的菌液制备同方法适用性实验，加菌量不大于 100 cfu1。笔者在监督抽检中发现，有的厂家为了节约成本，检验人员用新鲜液体培养基制备好菌液，检测一次菌液的含菌量，符合要求后就储藏于 4 冰箱多次使用，而在后面的使用中均按第一次的使用量加入，并没有每次使用时都检测所加入菌液量是否在规定范围内，导致企业在进行验证时实际加入的阳性对照菌量多于规定量甚至是规定量的几倍，阳性菌在规定培养条件下生长良好，出现了实验成立的假象。2 建议2.1 加强技术审查有关部门对生产企业上报的验证资料应加强技术审查，规范方法验证报告的书写格式，提高其可操作性。对一些实验操作不规范、实验信息记录不全的报告，要及时提出意见并督促其修改完善。2.2 加强专业培训学习检验人员应执行岗前培训制度，培训合格方能上岗操作，还要持续参加各类业务学习，掌握无菌检验方法、标准及相关法律法规。有关部门应组织长期从事无菌检查工作的专家，对于抗生素类注射剂方法验证中的重点、难点等注意事项以及可能出现的问题，给予相关从业人员技术指导。2.3 提高相关企业检测能力有关部门应督促企业参加各类水平测试和盲样测试，提高检测水平和分析问题、解决问题的能力。3 结语针对薄膜过滤法在抗生素类注射剂无菌检查中的使用，相关单位和技术人员要加强总结和培训，提高结果测定准确度，保证方法的应用成效。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部 M.北京:中国医药科技出版社,2020.2 郭明义,苏喜芝.药品检验中薄膜过滤法的应用价值 J.中国继续医学教育,2015,7(12):177-178.3 苏德模,马绪荣.药品微生物学检验技术 M.北京:华龄出版社,2007.4 李玉立,江志杰,刘文杰,等.中美现行药典无菌检查法比对J.中 国药业,2022,31(8):6-9.5 王似锦,高春.硫乙醇酸盐流体培养基成分、历史起源及应用研究进展 J.中国药业,2014,23(1):92-94.6 夏洁敏,朱澄.硫乙醇酸盐流体培养基的选择 J.上海