白方腐乳中产胺细菌分离鉴定及产胺性能检测.pdf

白方腐乳中产胺细菌分离鉴定及产胺性能检测苏泽，谭贵良”，刘子雄”，黄嘉曼”，李梅”，胡文锋1*3（中山市食品药品检测所，广东中山，52 8 43 7）研究报告D0I:10.13995/ki.11-1802/ts.033735引用格式：苏泽，谭贵良，刘子雄，等.白方腐乳中产胺细菌分离鉴定及产胺性能检测J.食品与发酵工业,2 0 2 3,49（17）：153-160.SU Ze,TAN Guiliang,LIU Zixiong,et al.Isolation,identification of biogenic amine-producing bacteria and their amine-producing characteristics in white sufu post-fermentation process J.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):153-160.1（华南农业大学食品学院，广东广州,510 6 42)2（电子科技大学中山学院，广东中山，52 8 40 2）摘要为了解白方腐乳生产过程中产胺菌类型及其产胺特性，从白方腐乳后发酵过程中分离获得8 株产生物胺细菌，并对其产生物胺性能进行研究。然后，通过16 SrDNA序列鉴定出拟蕈状芽孢杆菌（Bacillusparamy-coides）4株，其余4株分别为热带芽孢杆菌（Bacillustropicus）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、解淀粉芽孢杆菌（Ba c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。采用超高效液相色谱法分析发现8 个菌株产生物胺种类不同，但都具有产腐胺、尸胺和酪胺能力，其中产酪胺量最大（0.45 8 7.3 1mg/L）。菌株S5产生物胺总量最高，达10 6.3 4mg/L，其中酪胺量高达8 7.3 1mg/L。菌株S5生物胺产生量随着温度（15 3 5）升高而增加，但在温度 15%，氨基酸质量分数7.5,NaCl质量分数 6.0%条件下总生物胺和酪胺的产生受到抑制。该研究结果可为控制腐乳生产过程生物胺的产生提供参考。关键词白方腐乳；后发酵环节；产胺菌；分离；产胺特性腐乳是极具中国特色的大豆发酵食品之一，至今已有150 0 年的悠久历史。腐乳滋味鲜美、风味独特，广受消费者喜爱。腐乳按照色泽风味可分为白腐乳、红腐乳、青（臭)腐乳3 大类2 。腐乳的生产环节分为前发酵和后发酵2 个阶段。前发酵是通过自然接种或人工接种，培养富含蛋白酶的微生物；后发酵则是腐乳装瓶后酶与微生物协同作用3 ,后发酵阶段既是风味物质4-5 产生的主要阶段，也是有害物质生成的主要阶段6-7 。生物胺（biogenic amines,BAs）是一类广泛存在于食品中的低分子质量含氮有机化合物的总称，常见的有组胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺以及亚精胺。虽然人体摄人微量的生物胺能促进生长、增强代谢活力、增强免疫力和清除自由基等效用，但过量摄入生物胺则会引起头疼、腹部挛、呕吐等不良生理反应 。腐乳因富含蛋白质、氨基酸，容易累积生物胺。LI等9 检测了6 4种来自15个不同产地腐乳样品中的生物胺，所有样品均检测出腐胺、酪胺、苯乙胺、色胺以及尸胺等常见生物胺,其中白腐乳总生物胺含量高达53 3.54mg/kg。根据SANTOS等10-对生物胺的推荐毒性限量（苯乙胺3 0 mg/kg、组胺第一作者：硕士研究生（谭贵良教授和胡文峰副教授为共同通信作者，E-mail:；w f h u s c a u.e d u.c n）基金项目：广东省自然科学基金面上项目（2 0 2 0 A1515011308，2 0 2 2 A 15150 12 158）；广东省教学质量与教学改革工程建设项目（SJD202001）；中山市社会公益重大专项项目（2 0 2 0 B2010）收稿日期：2 0 2 2-12-2 8，改回日期：2 0 2 3-0 1-0 6100mg/kg酪胺10 0 8 0 0 mg/kg），目前从商品腐乳中检测出的苯乙胺（7 3 6.6 4mg/kg）12 、组胺（118 6.9 3 mg/k g）13 、酪胺(17 3 0 mg/kg)14含量均严重超过推荐毒性限量。本课题组前期对不同商品腐乳的研究也发现不同地区腐乳总生物胺含量差异很大（53.59 58 3 7.10 mg/kg）15,8 个样品中有5个都超过生物胶推荐最高污染水平10 0 0 mg/kgm这些结果表明,腐乳中生物胺含量过高已影响腐乳成品质量及食品安全性问题16 。生物胺的产生离不开微生物对氨基酸的脱羧反应，以及适合这些微生物合成氨基酸脱羧酶并发挥其作用的理化条件。前期对腐乳产生物胺菌的研究主要集中在微生物群落水平，例如LIANG等17 研究发现红方腐乳发酵菌群结构的变化会影响生物胺的生成，枯草芽孢杆菌和热带芽孢杆菌会在腐乳后发酵728d时增加组胺、酪胺、腐胺和尸胺的生成量。本课题组基于宏基因组鸟枪测序对我国市场上不同类型商品腐乳中产生物胺的微生物群落及重建物种进行了研究，发现重建物种含有不同种类的脱羧酶基因和丰度15 最近，陆续有从商品腐乳中分离鉴定出产胺菌的2023 年第49 卷第17 期（总第48 5期)153食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES报道。梁静静等18 从2 4种市售腐乳样品中分离出20株产胺菌，经过16 SrDNA鉴定后均为芽孢杆菌属。王维亚等19 从12 种不同品牌的江西腐乳中获取到6 株产胺菌（耐热芽孢杆菌、鲁梅利杆菌、耐硼赖氨酸芽孢杆菌和皮脂葡萄球菌），经检测发现这些菌产腐胺和酪胺的量最大。但至今未见从腐乳后发酵环节中分离出产胺菌的报道。基于此，本研究以广东典型白方腐乳后发酵过程样品为研究对象，对产胺菌进行分离、纯化和鉴定，并对典型菌株的产胺特性进行研究。目的是了解腐乳生产过程中的产胺菌种类和不同条件对产胺菌产胺特性的影响，为控制生物胺的产生提供基础。1材料与方法1.1试剂与仪器1.1.1样品白方腐乳后发酵样品，广东省江门市恩平县的一家传统腐乳生产厂。1.1.2试剂LB肉汤培养基：蛋白陈1%，酵母浸出粉0.5%，胰蛋白陈1%（均为质量分数）。产生物胺筛选培养基（g/L）：牛肉浸出粉5.0,酵母浸出粉5.0，胰蛋白陈5.0，葡萄糖0.5；吐温-8 01 mL;NaC1 2.5,FeSO4 0.04,MnS04 0.05,MgS04 0.2,K,HPO42,CaCO,0.1,柠檬酸铵2,维生素B,0.01,5-磷酸吡哆醛0.0 5,溴甲酚紫0.0 6,琼脂18。色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸各5,调节pH 至 5.3;12 1 灭菌 15 min 20。标准品：组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、磷酸吡哆醛（均为分析纯），美国Sigma公司;组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺、亚精胺（纯度9 8%），上海阿拉丁试剂有限公司；丹磺酰氯（纯度9 8%），分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司。DNA提取试剂盒，湖南艾科瑞生物工程有限公司；引物：2 7 F/1492R，T D 2/T D 5，上海生工生物工程股份有限公司；dNTPs、T a q D NA 聚合酶，TaKaRa;Sepharose6B琼脂糖，北京索莱宝科技有限公司；核酸染液、DNAMarker、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、ED-TA,北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司；乙酸，天津永大化学试剂有限公司。1.1.3仪器设备FA2004B电子分析天平，上海佑科仪器仪表有1542023 Vol.49 No.17(Total 485)限公司;HCB-900V超净工作台，青岛海尔生物医疗股份有限公司；DSX-24L-I高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂;LRH-150F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；PB-10酸度计，赛多维斯科学仪器（北京）有限公司;BX53生物显微镜，奥林巴斯（中国）有限公司；ST8R高速冷冻离心机、MAXQ4000台式恒温冷冻摇床、2 7 2 0 thermalcyclerPCR仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；WatersAlliance2695高效液相色谱系统，苏州市莱顿科学仪器有限公司;DYY-6C电泳仪,北京六一生物科技有限公司;BIO-RADGel-DocGO凝胶成像系统，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；VICTORNivo酶标仪，珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司。1.2实验方法1.2.1产胺菌的分离纯化及形态观察称取2 5g腐乳样品，在无菌条件下将腐乳溶于225mL无菌生理盐水，使用无菌玻璃棒进行研磨，搅拌均质，得到10-浓度的稀释液。分别从10-的稀释液中吸取1mL,按10-、10-3、10-4和10-5浓度稀释后,再从每个浓度稀释液中吸取10 0 L涂布于产生物胺筛选培养基平板上，于3 7 倒置培养2 4h，观察平板颜色变化。挑选不同稀释梯度平板上单个紫色菌落，用生理盐水按10-3、10-4和10-5梯度稀释后得到稀释菌液，再分别从每个梯度的稀释菌液中吸取100L涂布于产生物胺筛选培养基平板上，于3 7 倒置培养2 4h，观察平板颜色变化。按上述纯化过程重复2 3 次,得到单菌落。对分离菌株用LB肉汤培养基富集后，取单菌液进行革兰氏染色后于显微镜下进行形态学观察。1.2.2产胺菌的分子生物学鉴定DNA提取：按照SteadyPure细菌基因组DNA提取试剂盒说明进行提取。PCR扩增：采用16 SrDNA序列通用引物2 7 F(5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3）和 149 2 R（5-G G T T A C CT T G T T A CG A CT T-3 ）进行扩增。PCR扩增体系：45L1TSE101mix、引物2 7 F和引物149 2 R各2.0 L（10 m）、1.0 L模板DNA。PCR扩增条件:9 8 预变性2 min;98变性10 s,56复性10 s，7 2 延伸10 s/kb,共3 5个循环；72再延伸5min；最后于4保存。结果检测：将扩增好的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送样至深圳市易科吉生物科技有限公司进行测序，以鉴定产胺菌株种属。研究报告1.2.3超高效液相色谱法（ultraperformance liquidNaCl质量分数的影响：取1mL处于对数期菌悬chromatography,UPLC）法分析离菌株发酵液中的生液接种于10 0 mLLB肉汤培养基中,分别添加质量分物胺数为0、3.0%、6.0%和9.0%的NaCl,37、13 0 r/m in将上述步骤纯化得到的菌株接种于LB肉汤培摇床培养2 d,取1mL培养液用于UPLC分析,并设养基中富集培养8 10 h（对数期）,取1mL处于对空白对照。数期菌悬液接种于10 0 mLLB肉汤培养基中,添加质乙醇体积分数的影响：取1mL处于对数期菌悬量分数0.0 0 5%的磷酸吡哆醛和质量分数0.1%的氨液接种于10 0 mLLB肉汤培养基中,分别按体积分数基酸（组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和0、5%、10%、15%、2 0%、2 5%添加乙醇，3 7、赖氨酸）,13 0 r/min摇床培养2 d,取1mL发酵液于130r/min摇床培养2 d,取1mL培养液用于UPLCUPLC分析,平行测定3 次。分析,并设空白对照。生物胺含量的测定采用柱前衍生化法。样品前pH值的影响：取1mL处于对数期菌悬液接种于处理方法参考李大伟等2 1 的方法稍加修改。取100mLLB肉汤培养基中，调节pH值依次为4.5、1 mL上述步骤的培养液于15mL离心管中,加入5.5、6.5、7.5、8.5和9.5,3 7、13 0 r/min摇床培养400L1mol/LNa0H溶液，然后加入3 0 0 L的缓冲2 d,取1mL培养液用于UPLC分析,并设空