UPLC-MS_MS法测定茶叶中丙烯酰胺.pdf

12农业科技SCI-TECH&INFORMATIONPZNZHIHUAUPLC-MS/MS法测定茶叶中丙烯酰胺尚远宏，田金凤，张喆,孙卓然?1.攀枝花学院医学院，2.呼和浩特市疾病预防控制中心摘要采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-MS/MS）法测定绿茶、红茶和乌龙茶中丙烯酰胺含量。样品2.Og经正已烷去脂和乙睛提取，MCX固相萃取柱净化，采用WatersBEH-C18色谱柱分离，以0.1%的甲酸水溶液和乙睛溶液为流动相进行梯度洗脱；质谱条件采用电喷雾离子源（ESI)和多反应监测模式（MRM）,同位素内标法定量。结果表明，丙烯酰胺的质量浓度为5.0 1 6 0.0 g/L时，线性关系良好，相关系数（R）0.9 9 9,且精密度实验结果的相对标准偏差（RSD）为1.7 3%，定量限为1.5g/kg，加标回收率为8 8.0%9 6.8%。说明该方法精密度及准确度良好，能满足茶叶中丙烯酰胺含量检测的要求。关键词超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法；丙烯酰胺；茶叶茶作为一种快消饮品，其茶汤通过自身的香气和滋味来满足人们的饮用需求。在我国，绿茶、红茶和乌龙茶是人们普遍爱饮的茶类，其消费量逐年增加。同时，国家市场监督管理局颁布的食品生产许可分类目录中“茶叶及相关制品”里的“茶叶”项下包含了绿茶、红茶和乌龙茶，说明茶叶属于食品，可以进行市场流通。绿茶（炒青、烘青、晒青和蒸青四大类）为不发酵茶，其工序主要包括杀青、揉捻、干燥三个过程1；红茶属于完全发酵茶，为北方人所喜欢，主要加工技术为萎凋、揉捻、发酵、干燥等2 ；乌龙茶属于半发酵茶,主产于福建、广东、中国台湾三省,其加工过程主要分为萎调、做青、杀青、做形和干燥等3 。茶叶生产过程中可能产生的有毒物质丙烯酰胺现成为人们关注的焦点问题，丙烯酰胺属于二类致癌物4 ,存在于一些不同的热处理食品（油炸土豆片、烘焙咖啡、焙烤面包和绿茶5-6 等)中，而茶叶中的丙烯酰胺的来源可能主要集中在杀青或干燥处理（高温）阶段。在我国目前标准CB5009.2042014食品中丙烯酰胺的测定中尚未有明确规定茶叶中丙烯酰胺的限量标准7 ，而欧盟正式实施了关于丙烯酰胺的法案，对常见食物中的丙烯酰胺含量限值大多在3 0 0 8 50 g/kg，因此，我国在茶叶生产中也应严格控制丙烯酰胺形成途径，并有必要建立茶叶中丙烯酰胺的痕量检测方法。丙烯酰胺是在高温油炸或食品烘烤过程中因美拉德反应产生的副产物8 ,即高温易产生丙烯酰胺，它对人体有神经毒性和潜在的致癌性9 。目前关于茶叶中的丙烯酰胺132023年(总第1 53 期）攀枝花科技与信息第4 8 卷第2 期的检测报道较少，且鉴于一般的化学分析不能达到分析的要求，在实际应用的检测方法主要以仪器分析为主，当前已报导的检测手段为气相色谱法1 0 和液相色谱-串联质谱法-1 3 。然而，茶叶中成分复杂、干扰物较多，以现有的方法很难快速准确地分析低含量的丙烯酰胺。为了提高测定的灵敏度和准确度，本研究结合固相微萃取（solid phasemicroextraction,SPME）技术，利用同位素内标法定量（该法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响和在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差，有效提高方法的准确度和精密度），建立超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（ultra-performanceliquid chromatogra-phy-triple quadrupole massspectrometry,UPLC-MS/MS）法测定茶叶中的丙烯酰胺，并在前人研究工作的基础上1 2-1 3 ,适当改进样品前处理方法，先经过正已烷（除去低极性化合物）和乙腈等溶剂提取后经摇床振摇，目的为充分除杂和增加丙烯酰胺提取效率。同时，在茶叶生产中应严格控制丙烯酰胺形成途径和建立丙烯酰胺的痕量检测方法，可应用于茶叶的食品安全风险监测1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1材料绿茶、红茶和乌龙茶：市售。1.1.2化学试剂甲酸、乙（均为色谱级）：美国Fisher公司；丙烯酰胺、1 3 C3-丙烯酰胺标准品（纯度均 9 8%）：德国Dr.EhrenstorferGmbH公司;其他试剂均为国产分析纯1.2仪器与设备Agilent1290超高效液相色谱-6 4 6 0 串联四级杆质谱仪：美国Agilent公司；MCX固相萃取柱（8 0 0 mg/6mL）、1-1 4 k 离心机：美国Sigma公司;NEVAP-45氮吹仪：美国Orga-nomation公司;FA2014B电子天平：上海越平实验有限公司；Milli-QIQ7000超纯水器：美国Millipore公司。1.3方法1.3.1丙烯酰胺和1 3 C3-丙烯酰胺标准溶液的配制分别称取0.0 1 0 0 g丙烯酰胺或1 3 Cs-丙烯酰胺标准品，用水溶解并定容至1 0 mL,质量浓度均为1.0 mg/mL，-2 0 避光保存。其他质量浓度标准溶液用水定量稀释即得。1.3.2样品前处理分别称取茶叶样品2 g（精确到0.0 1 g），置于50 mL离心管中，加人1 0 0 L13C，-丙烯酰胺内标液（4 mg/L），加9 mL水并涡旋使试样分散，再加人5mL正已烷和1 0 mL乙腈涡旋1 min后，加人1.5g无水醋酸钠和6 g无水硫酸镁，室温下摇床振摇1 h，4、1 0 0 0 0 r/min离心8 min后，取乙腈层3 mL过MCX固相萃取柱,收集乙腈溶液，在氮气下吹干,用0.3mL水溶解残渣，过0.2 2 m滤膜后，即得样品溶液。1.3.3UPLC-MS/MS分析超高效液相色谱（UPLC）条件：WatersBEH-Cis色谱柱(1 0 0 mmx2.1mm,1.7m);流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0 1.2 min，乙体积分数为1 0%；1.2 3.0min，乙腈体积分数由1 0%线性升至90%;3.04.5min，乙睛体积分数为9 0%；4.55.0min，乙腈体积分数由9 0%线性降至10%；5 6 m i n，乙睛体积分数为1 0%；进样体14SCI-TECH&INFORMATIONPZNZHIHUA积：1 0 L;流速:0.2 mL/min。质谱（MS）条件：电子电离（electronic i-onization,EI)源；扫描方式：正、负离子扫描；检测方式：多反应监测（multiple-reaction mo-nitoring,MRM）；电喷雾离子源（electrosprayion-ization,ESI)电压：3 50 0 V;辅助气温度：300；辅助气流速：1 0 L/min。丙烯酰胺的MRM监测质谱参数见表1。定性定量方法参照文献1 4 。表1丙烯酰胺分析的质谱参数质荷比m/z化合物保留时间/min碰撞能量/eV裂解电压/V定量离子定性离子丙烯酰胺0.92872.1/55.272.1/44.31810013C,-丙烯酰胺0.92775.3/58.175.3/44.3121001.3.4建立标准曲线及测定检出限用空白绿茶基质提取液将2 0 0 g/L丙烯酰胺标准溶液分别稀释成5g/L、1 0 g/L、2 0 g/L、4 0 g/L和8 0 g/L、1 6 0 g/L系列质量浓度的标准溶液,其中含内标1 3 C3-丙烯酰胺50 g/L,分别进行测定。以丙烯酰胺标准溶液质量浓度（x）为横坐标，定量离子峰面积(y）为纵坐标，采用内标法建立丙烯酰胺标准曲线。以3 倍信噪比（S/N3）和1 0倍信噪比(S/N10)分别确定方法检出限与方法定量限15-171.3.5精密度试验取茶叶样品2 g，按1.3.2 节样品前处理后，其样品溶液再按1.3.3 节仪器条件进样，进行6 次平行试验。根据测定的峰面积计算其质量浓度,并计算分析结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)1.3.6加标回收率试验分别于绿茶、红茶、乌龙茶基质中添加标准液（5g/kg、2 5g/kg、1 0 0 g/kg)3个水平下，摇匀、静置后按1.3.2 节方法处理，进行加标回收率试验,考察该方法的准确性。1.3.7数据处理试验所得数据为3 次重复实验结果的平均值，采用MicrosoftExcel2010软件对试验数据进行统计分析，通过Origin7.5软件进行制图分析。2结果与分析2.1提取条件和仪器条件优化51,24321000.51.01.52.02.53.0时间/min1.13C,-丙烯酰胺(0.9 2 7 min）,2.丙烯酰胺(0.9 2 8 min)。图1丙烯酰胺混标溶液的总离子流色谱图提取条件中，样品提取过程中用正已烷目的是先将低极性化合物除去1 8 ,用醋酸钠可以加大样品中水的离子强度，通过盐析作用将待测样品中水层和乙腈层分离，而无水硫酸镁与水分子结合起到除水作用1 9 。仪器条件中，少量甲酸在色谱条件中主要目的是改善峰形，同时也为丙烯酰胺提供必需的2023年（总第1 53 期）攀枝花科技与信息第4 8 卷第2 期质子来源，提高其离子化效率；在ESI*模式下,丙烯酰胺和1 3 C3-丙烯酰胺经过两级碰撞扫描后，出现不同强度的离子碎片，通过离子强度相加可得到混合标准溶液总的离子流强度。丙烯酰胺在2 0.0 g/L时的MRM总离子色谱图见图1。表2丙烯酰胺的回归方程、线性范围和相关系数线性范围/LOD/LOQ/化合物线性方程相关系数R?(g L-)(g:kgl)(g kg*)丙烯酰胺y=373.92x-98.9480.999 851600.51.52.2方法的线性关系及检出限丙烯酰胺的线性范围、线性方程及相关系数见表2。表2 可知,丙烯酰胺在质量浓度5.0 1 6 0.0 g/L线性范围内其线性关系良好,相关系数(R）0.9 9 9。检出限（detec-tion limit,LOD)为0.5g/kg,定量限(limit ofquantitation,LOQ）为1.5g/kg，其方法的灵敏度能满足检测要求2.3方法的精密度试验茶叶样品经前处理后进样，平行测定6次,实验结果见表3,其相对标准偏差（RSD）为1.7 3%，表明该检测方法的精密度符合要求。2.4方法的加标回收率试验丙烯酰胺加标回收率试验结果见表4。由表4 可知,丙烯酰胺在茶叶中的平均回收率范围为8 8.0%9 6.8%，回收率测定结果相对标准偏差(RSD)为3.7 5%5.7 8%。结果表明,该检测方法的准确度符合要求。2.5实际样品分析按试验方法对市售茶叶2 0 个样品中丙烯酰胺的含量进行分析,结果见表5。表3精密度试验结果样品中丙烯酰胺含量（/gkg）RSD/%123456平均值14.614.914.514.414.914.314.61.73表4加标回收率试验结果样品样品中丙烯酰胺含量（/ugkg）加标量/(g kg)测定值/(gkg)回收率/%RSD/%17.9522.592.04.38绿茶18.32541.793.64.1517.1100111.294.13.75123.75128.392.05.62红茶120.425144.696.84.56125.2100148.593.24.7212.5516.988.05.78乌龙茶13.92536.791.25.0413.5100106.693.14.16由表5可知，茶叶样品中丙烯酰胺的含量均 1 50 g/kg，低于欧盟对常见食物中的丙烯酰胺含量限定范围（3 0 0 8 50 g/kg），说明国内市场流通的茶叶中丙烯酰胺的含量16PZNZHIHUASCI-TECH&INNFORMATION是相对安全的。其中,除8 个茶叶样品未检出之外，红茶中丙烯酰胺的含量范围在1 0.5146g/kg;绿茶中丙烯酰胺的含量范围在10.988.6g/kg;乌龙茶中丙烯酰胺的含量范围在7.9 2 1 3.2 g/kg；表明绿茶和乌龙茶的丙烯酰胺含量相对较低，而丙烯酰胺含量不同可能是由于对不同茶叶加工过程中丙烯酰胺的产生因素不同导致,或者由于绿茶提取物或茶中的儿茶素等作为强抗氧化物质降低丙烯酰胺含量的作用