不同载体材料固定Sphingobium.pdf

第 60 卷 第 4 期 土 壤 学 报 Vol.60，No.4 2023 年 7 月 ACTA PEDOLOGICA SINICA Jul.，2023 *国家重点研发计划项目（2020YFC1807000，2019YFC1804400，2019YFC1804203）、国家自然科学基金项目（42007133，41977137）和江苏省自然科学基金项目（BK20191107）共同资助 Supported by the National Key Research and Development Program of China（Nos.2020YFC1807000，2019YFC1804400，2019YFC1804203），the National Natural Science Foundation of China（Nos.42007133，41977137），and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province（No.BK20191107）通讯作者 Corresponding authors，E-mail：； 作者简介：尹 媛（1996），女，山东日照人，硕士研究生，主要从事环境化学研究。E-mail： 收稿日期：20220222；收到修改稿日期：20220420；网络首发日期（）：20220701 http:/ DOI：10.11766/trxb202202220071 尹媛，生弘杰，王紫泉，相雷雷，付玉豪，卞永荣，蒋新，王芳.不同载体材料固定 Sphingobium sp.PHE3 对溶液中菲的降解研究J.土壤学报，2023，60（4）：11921202.YIN Yuan，SHENG Hongjie，WANG Ziquan，XIANG Leilei，FU Yuhao，BIAN Yongrong，JIANG Xin，WANG Fang.Effects of Different Carrier Materials on the Degradation of Phenanthrene by Sphingobium sp.PHE3J.Acta Pedologica Sinica，2023，60（4）：11921202.不同载体材料固定Sphingobium sp.PHE3对溶液中菲的降解研究*尹 媛1，2，生弘杰3，王紫泉1，相雷雷1，付玉豪1，卞永荣1，2，蒋 新1，2，王 芳1，2（1.中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室，中国科学院南京土壤研究所，南京 210008；2.中国科学院大学，北京 100049；3.农业农村部长江下游平原农业环境重点实验室，江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，南京 210014）摘 要：为探究不同载体材料对微生物降解菲的影响，以蒙脱石、针铁矿、玉米秸秆炭为载体，采用吸附挂膜法对菲降解菌株（革兰氏阴性菌鞘脂菌 PHE3）进行固定化，并应用固定化微生物降解溶液中的菲。根据扫描电镜结果，该菌株在玉米秸秆炭载体表面附着生长数量最多，形态最优。添加蒙脱石和玉米秸秆炭显著（P0.05）提高了微生物对菲的降解率，加快了菲的微生物降解速率，同时促进了细菌胞外聚合物（EPS）中多糖和蛋白质产量的增加，但添加针铁矿对菲的微生物降解和EPS 的产生促进作用较弱。此外，鞘脂菌 PHE3 在形成生物膜的过程中可能有群体感应现象发生，能够分泌信号分子 C8-HSL和 C12-HSL，可能在一定程度上调控 EPS 的生成和污染物的降解。关键词：菲；微生物降解；载体；胞外聚合物；酰基高丝氨酸内酯 中图分类号：X53 文献标志码：A Effects of Different Carrier Materials on the Degradation of Phenanthrene by Sphingobium sp.PHE3 YIN Yuan1,2,SHENG Hongjie3,WANG Ziquan1,XIANG Leilei1,FU Yuhao1,BIAN Yongrong1,2,JIANG Xin1,2,WANG Fang1,2(1.Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.Key Laboratory of Agro-Environment in Downstream of Yangtze Plain,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Institute of Agricultural Resources and Environment,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China)4 期 尹 媛等：不同载体材料固定 Sphingobium sp.PHE3 对溶液中菲的降解研究 1193 http:/ Abstract:To explore the effect of different carrier materials on microbial degradation of phenanthrene,the biodegradation of phenanthrene was investigated in the liquid phase by gram-negative bacteria Sphingobium sp.PHE3 immobilized on montmorillonite,goethite and maize straw-derived biochar.The results of scanning electron microscopy showed that there was the largest number of bacteria adhered to the surface of the biochar with the best morphology.The addition of montmorillonite and biochar significantly(P97%，购自 TCI 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。实验过程中所用色谱纯有机溶剂丙酮、二氯甲烷、乙腈和 AHLs 标准品（C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3OC6-HSL、3OC8-HSL、3OC10-HSL、3OC12-HSL 和 3OC14-HSL），纯度99.9%，购自美国 Sigma-Aldrich 公司。蒙脱石、高岭石、针铁矿，纯度98%，购自国药集团化学试剂有限公司，过 100 目筛。玉米秸秆炭以玉米秸秆为原料，去离子水洗涤，烘箱烘干 12 h 后，于马弗炉中热解，热解温度为 500。制备好的玉米秸秆炭研磨过 100目筛。营养肉汤培养基购自青岛高科技工业海博生物技术有限公司，其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。实验所用营养肉汤培养基配方为：蛋白胨 10 gL1，牛肉浸粉 3 gL1，NaCl 5 gL1。无机盐培养基的配制方法24如下：称取 2.3 mg MnCl22H2O、3.0 mg MnCl4H2O、3.1 mg H3BO3、3.6 mg CoCl26H2O、1.0 mg CuCl22H2O、2.0 mg NiCl26H2O、3.0 mg Na2MoO42H2O 和 5.0 mg ZnCl2溶于 100 mL 去离子水配制微量元素溶液，调节 pH为 7；之后称取 8.8 g Na2HPO412H2O、3.0 g KH2PO4、1.0 g NH4Cl 和 0.5 g NaCl，加入 1 mL 1 molL1 MgSO4和 2.5 mL 微量元素溶液，定容至 1 L。菲降解菌鞘脂菌 PHE3（Sphingobium sp.PHE3）为本课题组从多环芳烃污染土壤中分离到的一株革兰氏阴性菌，能够以菲为唯一碳源生长，命名为PHE3，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC AB 2010361。菌株 PHE3 在灭菌的营养肉汤培养基中活化和进一步扩大培养，于 28、160 rmin1避光振荡培养，待菌株生长到对数期，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液清洗 2 次后，加入无机盐培养基重新悬浮菌体，调节 OD600 值为 0.85备用。1.2 载体筛选 向 40 mL 离心管中添加 0.1 g 载体（蒙脱石、高岭石、针铁矿和玉米秸秆炭），经灭菌处理后，继续添加 9 mL 灭菌的营养肉汤培养基，按照 10%的接种比例24，接种 1 mL 菌悬液，于 28、160 rmin1条件下避光振荡培养 2 d。培养结束后，离心收集载体，根据 Zhang 等25报道的方法观察附着在载体表面的细菌，首先用磷酸盐缓冲液清洗 2 次，接着加入 2.5%的戊二醛溶液固定 2 h，然后依次用 30%、50%、70%和 90%的乙醇脱水 10 min。最后样品经超临界干燥仪（Emitech K850，英国）干燥后采用扫描电镜（FEI Quanta 200，芬兰）观测。1.3 不同载体体系中菲的微生物降解 向 40 mL 玻璃离心管中添加 0.1 g 载体（蒙脱石、玉米秸秆炭、针铁矿），经灭菌处理后，向每支离心管中添加 9 mL 灭菌的无机盐培养基，随后分别添加 10 L 或 50 L 菲的丙酮溶液（2104 mgL1），使两种体系中菲浓度为 20 或 100 mgL1，然后按照10%的接种比例，接种 1 mL 已制备的菌液25，用盐酸将体系 pH 调整至 6.8 左右，同时设置不添加载体的接菌处理、只添加载体和不添加载体不接菌的对照处理。将所有的离心管置于摇床中，28、160 rmin1避光振荡培养，每隔一定时间破坏性取三组平行样品，测定菲残留量。另外取三组测定 EPS以及 AHLs。降解实验结束后，离心收集载体，采用扫描电镜观测载体上降解菌的负载情况。1.4 菲的提取和测定 每个处理取三组平行样品，每个离心管中加入20 mL 萃取剂（丙酮二氯甲烷=13，v/v）振荡混合，超声处理 2 h，提取残留菲26。取悬浮液2 000 rmin1离心 5 min，分离水相和有机相。有机相经 0.22 m 尼龙有机滤膜过滤。采用高效液相色谱法（Agilent1260，Agilent，美国），配备多环芳烃专用柱（250 mm4.6 mm，5 m）和荧光检测器，测定萃取物中的菲11。菲的激发波长为 245 nm，发射波长为 365 nm。流动相为乙腈和超纯水（91，v/v），流速为 1.5 mLmin1。在不同载体体系加入菲（20 mgL1）进行质量控制实验，采样和分析步骤与上述相同。菲的回收率在 99.7%105.2%之间。1.5 胞外聚合物的提取和测定 采用阳离子交换树脂法提取降解菌产生的EPS8。向不同处理组的离心管中加入 1.0 g 阳离子交换树脂（CER，0017，钠型，三兴），2 500 rmin1振荡 2 h，静置 5 min 以分离 CER。将上悬液在4 000 rmin1、4条件下离心 20 min，取上清液通4 期 尹 媛等：不同载体材料固定 Sphingobium sp.PHE3 对溶液中菲的降解研究 1195 http:/ 过 0.45 m 水系滤膜过滤去除颗粒和细菌细胞，4储存，之后用于 EPS 的生化成分分析。EPS 中的多糖含量采用苯酚硫酸法测定，以葡萄糖为标准物质绘制标准曲线27。EPS 中的蛋白质含量采用 Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白为标准物质绘制标准曲线25。1.6 A