miRNA-24靶向调控MEK_ERK信号通路对乳腺癌转移的作用.pdf

收稿日期:作者简介:曹琳(),女,硕士,主治医师,主要从事乳腺肿瘤的临床研究.通信作者:肖立新,主任医师,E m a i l:q q c o m.m i R N A 靶向调控ME K/E R K信号通路对乳腺癌转移的作用曹琳,尹红,朱静,段甚佳,肖立新(湖南省妇幼保健院乳腺外科,长沙 )摘要:目的探讨m i R NA (m i R )靶向调控ME K/E R K信号通路对乳腺癌转移的作用.方法体外培养乳腺癌(B C)细胞系MC F 、MD A MB 细胞以及非肿瘤性人乳房上皮细胞系H B F/M 细胞,采用q P C R方法检测各细胞中m i R 的表达水平.将MC F 细胞 分为 正 常组、m i R NA阴 性对 照 组(m i R N C组)和m i R 抑制剂组,采用C C K、伤口愈合试验和TUN E L检测细胞活力、迁移和凋亡情况,采用蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白和ME K/E R K通路相关蛋白的表达水平.结果m i R 在MC F 和MD A MB 细胞中的表达水平显著高于H B F/M 细胞(P).与m i R N C组相比,m i R 抑制剂组抑制了细胞的活力和迁移(P),促进了细胞的凋亡(P);其凋亡蛋白B c l 显著降低(P),B a x、c a s p a s e 和c a s p a s e 显著升高(P);同时降低了ME K/E R K信号通路的表达(P).结论乳腺癌细胞中m i R 表达升高,并且通过调控ME K/E R K信号通路促进乳腺癌的转移.关键词:m i R NA ;ME K/E R K信号通路;乳腺癌;转移中图分类号:R 文献标志码:A文章编号:()D O I:/j c n k i n c d m E f f e c t o fm i R N A T a r g e t e dR e g u l a t i o no fME K/E R KS i g n a l i n gP a t h w a yo nB r e a s tC a n c e rM e t a s t a s i sC A OL i n,Y I NH o n g,Z H UJ i n g,D U A NS h e n j i a,X I A OL i x i n(D e p a r t m e n t o fB r e a s tS u r g e r y,H u n a nM a t e r n a la n dC h i l dH e a l t hH o s p i t a l,C h a n g s h a ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e P u r p o s eT oe x p l o r e t h e e f f e c t o fm i R NA t a r g e t e d r e g u l a t i o no fME K/E R Ks i g n a l i n gp a t h w a yo nb r e a s t c a n c e rm e t a s t a s i s M e t h o d s T h ee x p r e s s i o no fm i R w a sd e t e c t e db yq P C Ri nB Cc e l l l i n e sMC F a n dMD A MB a n dn o n n e o p l a s t i ch u m a nb r e a s te p i t h e l i a l c e l l l i n eH B F/M T h eMC F c e l l sw e r ed i v i d e di n t on o r m a lg r o u p,m i R NA n e g a t i v ec o n t r o lg r o u p(m i R N Cg r o u p),a n dm i R i n h i b i t o rg r o u p C e l lv i a b i l i t y,m i g r a t i o na n da p o p t o s i sw e r em e a s u r e db yC C K,w o u n dh e a l i n gt e s ta n dTUN E La s s a y s,r e s p e c t i v e l y T h ee x p r e s s i o nl e v e l so f a p o p t o s i s r e l a t e dp r o t e i n sa n dME K/E R Kp a t h w a y r e l a t e dp r o t e i n s i nB Cc e l l sw e r ed e t e c t e db yW e s t e r nb l o t t i n g R e s u l t s T h ee x p r e s s i o no fm i R i nMC F a n dMD A MB c e l l sw a sh i g h e r t h a nt h a t i nH B F/M c e l l s(P)C o m p a r e dw i t ht h em i R N Cg r o u p,c e l l v i a b i l i t ya n dm i g r a t i o nw e r es u p p r e s s e d i nt h em i R i n h i b i t o rg r o u p(P)F u r t h e r m o r e,t h em i R i n h i b i t o rp r o m o t e dc e l la p o p t o s i sw i t hd e c r e a s e dB c l e x p r e s s i o na n di n c r e a s e dB a x,c a s p a s e a n dc a s p a s e e x p r e s s i o n(P)I na d d i t i o n,ME K/E R Kp a t h w a y r e l a t e dp r o t e i n sw e r ed o w n r e g u l a t e d i nt h em i R i n h i b i t o rg r o u p(P)C o n c l u s i o nm i R i sh i g h l ye x p r e s s e di nB Cc e l l s,a n dp r o m o t e sB C m e t a s t a s i sb yr e g u l a t i n g ME K/E R Ks i g n a l i n g南昌大学学报(医学版)年第 卷第期J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(M e d i c a lS c i e n c e s),V o l N o p a t h w a y K E Y WO R D S:m i R ;ME K/E R Ks i g n a l i n gp a t h w a y;b r e a s t c a n c e r;m e t a s t a s i s乳腺癌(B C)是一种发生在乳腺上皮组织中的恶性肿瘤,全世界B C的发病率持续上升,每年发现约 万例新发病例,预计未来 年B C的发病率和病死率将显著增加,同时发生B C的年龄显著下降.目前B C手术、化疗、放疗总生存率低,预后较差.因此,为提高B C患者的治愈率与生存率,确定B C治疗的有效新靶点十分迫切.M i c r o R N A(m i R N A)是小非编码R N A,约 个核苷酸,在转录后抑制靶R NA以调节多种细胞过程,参与肿瘤生物学,包括发育、细胞增殖、分化、凋亡、转移和侵袭.在不同物种中高度保守而丰富的m i R NA是m i R ,它与号染色体(第组:m i R b,m i R b和m i R )和 号染色体(第组:m i R a,m i R a和m i R )上的另外个m i R NA聚类.m i R 在乳腺癌、胶质瘤、喉癌中有表达,其中在喉癌中起到肿瘤抑制作用.不少m i R NA的失调可能通过异常激活ME K/E R K通路来促进肿瘤发生 ,但在乳腺癌中m i R NA靶向ME K/E R K信号的调控仍未见报道.本研究旨在探讨m i R 靶向调控ME K/E R K信号通路对乳腺癌转移的作用.研究方法细胞培养和细胞转染MC F 、MD A MB 人乳腺癌细胞系,以及H B F/M 非肿瘤性人乳房上皮细胞系均购自中国科学院细胞库.MD A MB 细胞在含有 胎牛血清,gm L青霉素和gm L链霉素的DMEM中维持,培养条件 和C O.MC F 和H B F/M 细胞在MEM 培养基中维持,补充剂和培养条件与MD A MB 细胞 相 同.将 汇 合 处 的MC F 细 胞 用 n m o lLp r e m i R 进行瞬时转染,分为正常组、m i R NA阴性对照组(m i R N C组)和m i R 抑制剂组,在 下孵育 h后进行随后的实验.C C K 检测采用C C K 检测细胞活力.将细胞接种在 孔板(细胞孔)并在、h检查.将检测缓冲液(L培养基与C C K 的比例为)加入到每个孔中.在 孵育h后,用酶标仪检测O D n m的吸光度.伤口愈合试验采用伤口愈合试验检测细胞迁移.将细胞接种在孔板(细胞孔)并在 孔板中生长至 汇合,在细胞单层中产生个线性划痕,之后在无血清培养基中处理细胞并允许迁移 h.在A x i o V e r t M荧光显微镜下捕获、h伤口区域的图像.细胞迁移率(h划痕宽度 h划痕宽度)/h划痕宽度.T U N E L检测采用TUN E L检测细胞凋亡.收集细胞并用P B S洗涤次,用多聚甲醛在室温下固定细胞 m i n,并 用P B S洗 涤.在P B S中 加 入 T r i t o nX 并 在 室 温 下 孵 育 m i n,将 LTUN E L测定溶液(罗氏诊断有限公司)加入细胞中,并在 下黑暗中孵育 m i n,接下来,将细胞与D A B一起孵育,并在室温下用苏木精和曙红染色m i n.后丢弃检测溶液,用P B S洗涤细胞次,并用抗荧光淬灭密封溶液密封.随机选择个视野 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察.激 发 波 长 n m,发射波长 n m(绿色荧光).荧光定量聚合酶链反应(q P C R)采用q P C R检测细胞中m i R 的表达水平.将细胞接种到孔板中,密 度 为 细 胞 孔,使用R NA纯化的总R NA提取试剂盒(赛默飞世 尔 科 技 公 司)、S MA R T MML C逆 转 录 酶(T a k a r aB i o t e c h n o l o g yC o,L t d)在 下进行c D NA的逆转 录 m i n,q P C R反 应 混 合 物 含 有 L XT a qP C R主混料、L引物、Lc D NA模板和L无R NA酶,以H GA P DH或U 作为m i R 的 内 源 性 对 照.热 循 环 条 件 如 下:m i n,次循环,循环 s,循环 s,循环 s.使用E x i c y c l e r(B i o n e e rTMC o r p o r a t i o n)进行扩增,并根据 C t计算相对表达水平.蛋白质印迹分析采用蛋白质印迹法检测B C细胞凋亡相关蛋白和ME K/E R K通路相关蛋白的表达水平.将总细胞样品用冰冷的P B S洗涤次,并在裂解缓冲液中孵育 m i n;使用B C A蛋白质测定试剂盒(上海S a n g o nB i o t