miR-27a通过Wnt_β-catenin通路对骨质疏松小鼠颅骨缺损的修复效果及机制研究.pdf

Chin J Prosthodont,July 2023,Vol.24,No.4口腔颌面修复学杂志2023年7月第24卷第4期 论著 miR-miR-2727a a通过通过Wnt/Wnt/-catenin-catenin通路对骨质疏松小鼠颅骨缺损的通路对骨质疏松小鼠颅骨缺损的修复效果及机制研究修复效果及机制研究*王茜余炜伟李光辉【摘要】目的：探讨miR-27a对骨质疏松小鼠颅骨缺损的修复效果以及对Wnt/-catenin通路的调节作用。方法：40只小鼠建立骨质疏松颅骨缺损模型，随机分为模型组、miR-27a NC组、miR-27a mimic组和miR-27ainhibitor组，另外10只骨质疏松小鼠作为对照组。对照组和模型组小鼠尾静脉注射10 L生理盐水，其余组小鼠分别尾静脉注射10 L miR-27a 阴性对照质粒、miR-27a 过表达慢病毒质粒和miR-27a 沉默慢病毒质粒，1次/周，连续4周。micro-CT检测颅骨愈合情况，ELISA检测血清中碱性磷酸酶（ALP）、钙和磷水平，qRT-PCR法和蛋白印迹法检测骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）基因和蛋白表达量，蛋白印迹法检测细胞核和细胞质中-catenin蛋白表达情况。结果：与对照组比较，模型组小鼠ALP活性、钙和磷水平，OCN和OPN mRNA和蛋白水平均降低（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组小鼠BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度，ALP活性、钙和磷水平，OCN和OPN基因和蛋白水平均升高，miR-27a inhibitor组小鼠BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度，ALP活性、钙和磷水平，OCN和OPN 基因和蛋白水平均降低（P0.05）；与对照组比较，模型组细胞质中-catenin蛋白表达高于细胞核（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组细胞质中-catenin蛋白表达低于细胞核，而miR-27a inhibitor 组细胞质中-catenin蛋白表达高于细胞核（P0.05）。结论：miR-27a可诱导骨质疏松小鼠颅骨缺损内新骨形成，其可能是通过激活Wnt/-catenin信号通路发挥作用。关键词：骨质疏松；颅骨缺损；miR-27a；Wnt/-catenin信号通路中国图书分类号 R780.2 文献标识码 ADOI:10.19748/.kqxf.1009-3761.2023.4.003Repair effect and mechanism of miR-27a on calvarial defects in osteoporotic mice via Wnt/-catenin pathwayWANG Qian,YU Wei-wei,LI Guang-hui*.(Stomatological Center,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China)【Abstract】Objective:To investigate the repair effect of miR-27a on calvarial defects in osteoporotic mice and theregulating effect of miR-27a on Wnt/-catenin pathway.Methods:The osteoporotic skull defect model was establishedin 40 mice,then were randomly divided into the control group,the model group,the miR-27a NC group,the miR-27a mimicgroup and the miR-27a inhibitor group,another 10 osteoporosis mice served as a control group.Mice in the control groupand the model group were injected with 10 L normal saline through tail vein.Mice in the other groups were injected with10 L miR-27a negative control plasmid,miR-27a over expressing lentivirus plasmid and miR-27a silencing lentivirusplasmid by tail vein,once a week for 4 weeks.The skull healing was detected by micro-CT,the serum alkaline phosphatase(ALP),calcium and phosphorus levels were detected by ELISA,the gene and protein expressions of osteocalcin(OCN)and osteopontin(OPN)were detected by qRT-PCR and western blotting.The expression of-catenin in the nucleus andcytoplasm was detected by western blotting.Results:Compared with the control group,ALP activity,calcium andphosphorus levels,OCN and OPN mRNA and protein levels were decreased in the model group(P0.05).Compared withthe miR-27a NC group,BV/TV,bone trabecular number,bone trabecular thickness,ALP activity,calcium and phosphoruslevels,OCN and OPN mRNA and protein levels were increased in the miR-27a mimic group.BV/TV,bone trabecularnumber and bone trabecular thickness,ALP activity,calcium and phosphorus levels,OCN and OPN mRNA and proteinlevels were decreased in the miR-27a inhibitor group(P0.05).Compared with the control group,-catenin proteinexpression in the cytoplasm of the model group was higher than that in the nucleus(P0.05).Compared with the miR-27aNC group,the expression of-catenin in the cytoplasm of the miR-27a mimic group was lower than that of the nucleus,while that of the miR-27a inhibitor group was higher than that of the nucleus(P0.05).Conclusion:miR-27a can induce 基金项目基金项目：河南省医学科技攻关计划（联合共建）项目（项目编号：LHGJ20190272）王茜郑州大学第一附属医院口腔医学中心副主任医师郑州450000余炜伟郑州大学第一附属医院口腔医学中心主任医师郑州450000李光辉通讯作者郑州大学第一附属医院口腔医学中心副主任医师郑州450000253口腔颌面修复学杂志2023年7月第24卷第4期Chin J Prosthodont,July 2023,Vol.24,No.4new bone formation in osteoporotic mice skull defects,possibly through activation of Wnt/-catenin signaling pathway.Key words:osteoporosis;calvarial defect;miR-27a;Wnt/-catenin signaling pathway骨质疏松症好发于中老年人群，是一种全身代谢性骨病1。骨质疏松症患者由于骨代谢异常，常发生骨折延迟愈合、骨不连和骨缺损等临床症状，目前仍是临床工作者面临的医学难题。研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）-27a-3p可改善骨质疏松临床症状，诱导成骨细胞分化2。此外，骨髓间充质干细胞来源的富含miR-27a-3p的外泌体可促进骨质疏松大鼠成骨能力3。Wnt/-catenin信号通路与成骨分化、骨形成以及骨质疏松等骨性疾病密切相关，研究表明，Wnt/-catenin信号通路激活在促进骨再生过程中发挥重要作用4。适当的机械负荷通过激活Wnt/-catenin信号通路可逆转核苷酸类似物逆转录酶抑制剂TDF对骨质丢失、骨损伤修复的负面影响5。基于以上研究，本研究主要探讨miR-27a在骨质疏松小鼠颅骨缺损修复中的效果及其具体机制。1.材料和方法1.1 实验动物 SPF级雌性C57BL/6小鼠60只，12周龄，体质量2225 g，购自北京科兴中维生物技术有限公司，许可证号：SYXK（京）2020-0054。该研究经本院动物伦理委员会审核批准，伦理审批号为：ZZDXDYFSYY78542。1.2 试剂和仪器 GenBank用于查找序列并获得基因序列，构建miR-27a过表达、沉默以及阴性对照质粒，慢病毒滴度为1109TU/mL；胎牛血清和培养基购自美国 Gibco 公司；碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）、血钙和血磷试剂盒购自南京建成生物工程研究所；骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和-catenin 引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成；兔抗OCN、OPN和-catenin抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的IgG购自美国Sigma公司；DYCZ-MINI2型双板垂直电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；Varioskan LUX 多功能酶标仪购自美国 ThermoFisher公司；DHP-9162恒温培养箱购自武汉诺瑞德科技有限公司；Applied Biosystems PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。1.3 骨质疏松模型制备6随机取10只小鼠作为假手术组，另外50只小鼠作为去卵巢组，所有小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）麻醉。麻醉成功后取俯卧位固定于鼠板上，去卵巢组小鼠在背部脊柱两侧腹腔部位约0.5 cm处分别做一切口，剪开肌肉层和腹膜层，找到粉红色“菜花样”组织即为卵巢组织，眼科剪剪除，分层缝合切口，假手术组小鼠打开腹腔，仅切除卵巢周围与卵巢大小相同的脂肪组织。饲养8周后，假手术组和去卵巢组小鼠进行股骨影像学检查，确定模型是否制备成功。1.4 骨质疏松小鼠颅骨极限缺损模型制备和干预方式 将造模成功的 50只小鼠随机分为对照组、模型组、miR-27a 过表达组（miR-27a mimic组）、miR-27a 抑制剂组（miR-27a inhibitor 组）以及 miR-27a阴性对照组（miR-27a NC 组），每组10只。