LPY6缓解镉对小麦毒害效应的研究.pdf

文章编号：1674 7054(2023)04 0364 07LPY6 缓解镉对小麦毒害效应的研究夏影影，于燕燕，陶均（海南大学 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/热带作物学院，海口 570228）摘要：为了分析从阴沟肠杆菌 Cu6 驯化获得的高镉抗性菌株 LPY6 在镉（Cd）修复中的潜力和机制，为镉污染修复工程菌的开发提供依据，以小麦（Triticum aestivum）为材料，进行了种子萌发和盆栽实验，结果显示，LPY6 可缓解镉对小麦生长的抑制作用。Cd2+吸附特征实验表明，LPY6 可以降低培养液中游离镉的浓度。此外，LPY6 还可以降低土壤有效镉浓度和小麦幼苗中镉的积累。研究结果表明，LPY6 可能通过吸附或内吸镉作用，降低土壤中有效镉的浓度，进而降低镉离子进入植物的可能性，提高植物在高镉环境中的生存能力。关键词：阴沟肠杆菌；LPY6；镉污染；小麦；解毒能力中图分类号：S 512.1;X 53 文献标志码：A引用格式：夏影影，于燕燕，陶均.LPY6 缓解镉对小麦毒害效应的研究 J.热带生物学报，2023,14（4）：364370.DOI：10.15886/ki.rdswxb.2023.04.003 调查结果表明，我国农业土壤的镉（Cd）含量在过去一段时间内呈急剧增加态势1 2。由于镉的不可降解性，土壤镉污染已成为严重的农业污染问题，并威胁着人们的身体健康，急需高效的修复措施3。在土壤重金属污染修复策略中，生物修复被广泛关注。其中，微生物修复通过土壤中重金属的吸附富集，溶解沉淀以及氧化还原等机理，降低或去除土壤中过量的重金属4。不同的微生物可以通过不同的机制来修复土壤镉污染，如吸收和螯合5、胞内积累6以及矿化7等。能修复镉污染的微生物主要包括细菌、真菌与藻类。土壤细菌也可以通过改变土壤环境条件，产生促进植物生长物质等多种方式以提高土壤重金属迁移率和生物利用度8。在高镉的环境中，通过加入可高抗镉并具有镉吸附能力的细菌可修复土壤的镉污染9。因此，获得高抗镉菌是利用细菌修复镉污染土壤的前提。但大多已报道的抗性菌株并没有表现出特别高的镉抵抗能力10 11。此外，多数菌株只对少数重金属具有抗性10，而土壤重金属污染多为多金属污染12，这导致细菌在重金属环境中难以生存或繁殖，因此很难达到理想的修复效果。笔者所在实验室前期也从海南昌江矿区分离获得抗镉、铜、锌、锰、钴等多种重金属的阴沟肠杆菌Cu613，并通过驯化获得了其他重金属抗性未发生显著变化而抗镉能力显著增强的菌株 LPY614。本研究以粮食作物小麦（Triticum aestivum）为植物材料，拟分析 LPY6能否缓解镉对小麦生长的抑制作用以及可能的机制，旨在为进一步开发镉污染修复工程菌提供依据。1材料和方法 1.1菌株 供试菌株为笔者所在实验室前期从海南昌江石碌矿区分离出的阴沟肠杆菌 Cu6 13以及驯化后得到的高抗镉菌株 LPY614。1.2试剂 盐酸（HCl，优级纯）、硝酸（HNO3，优级 纯）、水 合 氯 化 镉（CdCl22.5H2O）、硫 酸 铜（CuSO4）、硫酸铅（PbSO4）和氯化锰（MnCl2）、过氧化氢（H2O2）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、三乙醇胺（TEA）和氯化钙（CaCl2）。所使用试剂均购自广州化学试剂公司。收稿日期：2022 06 11修回日期：2022 09 22基金项目：海南省自然科学基金项目（2019RC063）第一作者：夏影影（1992），女，海南大学热带作物学院 2019 级硕士研究生.E-mail：通信作者：陶均（1976），男，副教授，博士.研究方向：微生物与环境的互作.E-mail： 第 14 卷 第 4 期热 带 生 物 学 报Vol.14 No.42023 年 7 月JOURNALOFTROPICALBIOLOGYJul.2023 1.3培养基 Luria-Bertani（LB）培养基（液体）：10 g Tryptone，10 g NaCl，5 g Yeast Extract，蒸馏水 1 L。LB 固体培养基：液体 LB+1.5%琼脂。含金属离子的 LB 培养基加相应浓度的各种金属。MS 培养基为实验室购买的粉末状成品，使用时可以直接溶于超纯水中，本实验使用 1/4 含量的MS 液体培养基。1.4植株 供试植株为小麦（T.aestivum），品种为铜麦 6 号，购于陕西大唐种业股份有限公司。1.5菌株 LPY6 对金属抗性的测定 细菌镉最低抑制浓度（抑制细菌生长的最低镉浓度）和最大耐受浓度（仍有部分细菌生长的最大镉浓度）的测定。Cd2+、Pb2+、Cu2+和 Mn2+的质量浓度均设置为0、300、500、1 000、2 000、3 000、5 000 mgL1，然后将 LPY6 菌株分别接种到含各浓度不同金属的LB 液体（30，180 rmin1）和 LB 固体培养基（30）中，每组处理设置 3 个重复，观察并记录菌株生长情况。1.6小麦种子萌发实验 将滤纸放置在培养皿中，添加 20 mL 含不同浓度（0、50、100、200、300、500 mgL1）CdCl22.5H2O 溶液到培养皿中，待滤纸完全浸湿后，选取较为饱满且大小较一致的小麦种子放置于滤纸上（每皿放 12 粒）。盖上盖子，在光照培养箱里静置 35 d（28，16 h 光照、8 h 黑暗，80%湿度），以伸出种皮的胚根等于或长于种子长度为标准，确定计算种子发芽率。然后，以显著抑制种子萌发的镉浓度来处理种子，分析 LPY6 是否有缓解镉对种子萌发的影响，设置 4 个处理（每处理 3 个重复）：CK（对照：1/4 MS培养基）、Cd、Cd+Cu6、Cd+LPY6（CdCl22.5H2O：500 mgL1，菌液浓度：OD600=0.1），进行萌发率统计（种子发芽率=种子发芽数/种子总数100%）。1.7小麦盆栽实验 首先检测小麦种子在土壤中的耐镉能力。采用营养土与红土混合土壤（V营养土V红土=12），干燥一段时间（室温、通风、30 d）待土壤平衡稳定后，分装至聚乙烯塑料盆（7 cm7 cm8 cm），每盆约 110 g，设置土壤镉含量为 0、360、720、1 000、1 500、1 800、2 200、2 500 mgkg1，每处理 3 个重复。挑取颗粒饱满小麦种子进行育苗，4 d 后移栽长势一致的小麦幼苗于处理后的土壤中，每盆 6 棵（14 h 光照、8 h 黑暗，26）。每 4 天观察记录植物苗的生长状况，直至 16 d。小麦生长在含有不同镉含量的土壤中。然后以此镉含量（1 000、1 500 mgkg1）来分析 LPY6 是否有缓解镉对小麦的毒害作用，设置9 个处理（每处理 3 个重复）：镉和细菌 2 个因素，每 个 因 素 3 个 水 平（镉 浓 度：0、1 000、1 500mgkg1；细菌：不加菌、加 Cu6、加 LPY6），完全随机设计。菌液终浓度 OD600=0.1。观察并统计小麦生长状况。1.8测定指标与方法 1.8.1 小麦生物量、生长指标测定小麦生物量、生长指标测定 按步骤1.7 处理，待小麦生长至 14 d 后，小心分别取出各处理的小麦苗，将其根部冲洗干净，然后擦拭干净，进行称重、记录鲜质量。测量株高，根长以及根毛数并记录。然后将小麦苗整株放入 65 烘箱，3 d 后取出（此时已完全烘干），记录其干质量。1.8.2 小麦苗镉含量测定小麦苗镉含量测定 采用原子吸收光谱法测定15。将上述烘干的小麦苗充分研磨粉碎，每个处理称取 0.1 g 置于试管中，分别加入 1 mLHNO3和 0.5 mL 的 H2O2，设空白对照。用安东帕Multiwave 7 000 超级微波消解系统消解（海南大学分析测试中心）。消解样品转入 15 mL 离心管，分别加超纯水定容至 10 mL，使用原子吸收光谱仪（海南大学分析测试中心）测定镉含量。1.8.3 培养基中游离镉浓度测定培养基中游离镉浓度测定 LPY6 单菌落接种到 LB 液体培养基培养（30，180 rmin1），16 h 后按 11 000（体积比）的比例转接于新鲜预热的 LB 培养基中，培养至对数生长期（OD600=0.8），制备 OD600=2.0 的菌悬液。以 2%的接种量将 LPY6 菌液接种到含不同质量浓度镉（0、150、250、500、1 250、1 500 mgL1）的液体培养基中，30、180 rmin1培养 48 h，以不接菌空白培养基为对照，每组处理 3 个重复，每隔 12 h 取菌液，菌液先测 OD600值，然后进行离心（10 000 rmin1,5 min），使用原子吸收光谱仪对上清液中的镉含量进行测定。计算 LPY6 菌降低游离镉的能力：q=(C1C2)/C1100%，式中：q 为吸附率；C1为空白对照组上清液中镉的浓度；C2菌处理组上清液中镉的浓度；单位：mgL1。1.8.4 土壤有效镉含量测定土壤有效镉含量测定 采取 DTPA 作提取剂用原子吸收光谱法测定土壤中有效态镉15。设置 土 壤 镉 含 量 为 0、360、720、1 000、1 500第 4 期夏影影等:LPY6 缓解镉对小麦毒害效应的研究365mgkg1。设置 4 个处理：CK（对照，不含镉），只有镉，镉加 Cu6，镉加 LPY6 分别处理土壤。每个处理设置 3 个重复。17 d 后，将处理的土壤风干后过筛（2 mm）。1 g 土壤加入 25 mL DTPA 提取剂，放入培养箱（25，180 rmin1）,2 h 后取样，上清液过滤（0.22 m）后，加 1%HCl 定容至 10 mL，火焰法测得样品的镉含量。以 DTPA 为对照，土壤中有效态镉含量以质量分数 w 表示：w=(CC0)V2V/mV1,式中：C 为镉校准曲线上查的质量浓度（mgL1）；C0为空白对照浓度；V2为定容体积（mL）；V 为样品所使用的提取液体积；V1为提取液体积;m：为试样质量（g）。1.9数据分析 采用 GraphPad Prism 9 进行数据分析与作图，实验重复 3 次，计算平均值标准差。2结果与分析 2.1菌 株 LPY6 具 有 多 种 重 金 属 抗 性 镉（CdCl22.5H2O）、铜（CuSO4）、铅（PbSO4）和 锰（MnCl2）的抗性实验表明，菌株 LPY6 对 4 种金属均具有较强抗性(耐性)。LPY6 对 Cd2+的最小抑制质量浓度为 2 500 mgL1，Cu2+为 400 mgL1，Mn2+为 500 mgL1。LPY6 对 Cd2+的最大耐受质量浓度为 3 000 mgL1，Cu2+为 450 mgL1，Mn2+为2 000 mgL1。实验中发现，质量浓度高于 1 000mgL1的含铅培养液容易生成白色沉淀，所以无法确定 Pb2+对 LPY6 的最小抑制浓度以及 LPY6对 Pb2+的最大耐受浓度，但菌株 LPY6 对铅有较高抗性（1 000 mgL1）。2.2LPY6 缓解镉对小麦种子萌发的抑制作用 为分析 LPY6 是否具有缓解镉污染的潜力，首先找出抑制小麦种子发芽的临界 CdCl22.5H2O质量浓度为 500 mgL1后，选用此浓度进行种子萌发实验。如图 1 所示，小麦种子在无镉条件下，其萌发率约为 80%；单独添加 500 mgL1CdCl22.5H2O 时，种子萌发率显著被抑制；加镉同时添加 Cu6 时，萌发率没有明显提高；但同时添加LPY6 和镉时，萌发率恢复到 65%左右，只是萌发速度比对照要慢，结果说明，LPY6 具有一定的缓解镉抑制小麦种子萌发的能力。CKCK(a)0萌发率/%CdCdCd+Cu6Cd+Cu6Cd+LPY6Cd+LPY620406080100(b)*图 1 LPY6 缓解镉对小麦种子萌发的抑制作用小麦种子在 500 mgL1镉和 LPY6（OD600=0.1）处理下的萌发状况（a）和萌发率（b），*:P0.0001。2.3LPY6 对镉毒害小麦幼苗生长的缓解作用 用盆栽实验来分析 LPY6 缓解镉毒害小麦的作用。同萌发实验一样，首先测定盆栽条件下显