SLC1A5协同TM4SF1通过mTOR信号通路调控食管鳞癌细胞迁移.pdf

2023,27(14):33-39,45.实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice33SLC1A5协同TM4SF1通过mTOR信号通路调控食管鳞癌细胞迁移胡效林1，郝鑫，李文倩1，赵恬恬1，侯思聪（1.扬州大学附属医院消化内科，江苏扬州，2 2 50 0 1；2.扬州大学医学院临床医学系，江苏扬州，2 2 50 0 1；3.江苏省宝应县人民医院消化内科，江苏宝应，2 2 58 0 0）摘要：目的探讨氨基酸转运载体溶质载体家族1成员5(SLC1A5）在食管鳞癌（ESCC)中的表达及其与临床病理特征的相关性，以及SLC1A5对ESCC细胞迁移的影响及潜在分子机制。方法采用TNM plot在线数据库分析 SLC1A5基因在ESCC组织和正常组织中的表达情况。通过实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测ESCC组织和癌旁组织中SLCIA5mRNA表达情况；采用免疫组化（IHC）法检测SLC1A5蛋白表达情况，并分析其与患者临床病理资料的相关性。分别构建SLC1A5过表达（SLC1A5-0E组）、四跨膜蛋白超家族成员1过表达（TM4SF1-OE组）、SLC1A5和TM4SF1共同过表达的Eca109细胞。采用细胞增殖试验、Transwell实验检测Eca109细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过免疫共沉淀（IP）实验证实SLC1A5和TM4SF1的相互作用；采用蛋白质免疫印迹（WB）法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关蛋白的表达水平。结果TNMplot数据库分析显示，ESCC组织中SLC1A5基因表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P0.05）。ESC C 组织中SLC1A5mRNA表达高于成对的癌旁组织,差异有统计学意义（P0.05）。T r a n s w e l l 实验结果显示，与Con组比较，SLC1A5-OE组细胞迁移及侵袭能力增强，差异有统计学意义（P0.01）。I P结果表明，SLC1A5与TM4SF1存在相互作用。WB结果显示，相对于SLC1A5-OE组或TM4SF1-OE组，p-mTOR、p-S6 蛋白表达水平在SLC1A5和TM4SF1共同过表达的细胞中最高。Transwell实验证实，共同过表达SLC1A5和TM4SF1的ESCC细胞迁移能力最强。结论ESCC中SLC1A5呈高表达，且与患者临床分期、淋巴结转移显著相关，SLC1A5可能通过与TM4SF1相互作用，激活mTOR信号通路，进而促进ESCC细胞迁移。关键词：氨基酸转运载体溶质载体家族1成员5；四跨膜蛋白超家族成员1；食管鳞癌；转移；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路中图分类号：R735.1；R446 文献标志码：A文章编号：16 7 2-2 353（2 0 2 3)14-0 33-0 7 D0I：10.7 6 19/j c m p.2 0 2 30 7 7 2SLC1A5 combined with TM4SF1 regulatesthe migration of esophageal squamous cellthrough mTOR signaling pathwayHU Xiaolin 2,HAO Xin,LI Wenqian 2,ZHAO Tiantian 2,HOU Sicong(1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001;2.Department of Clinical Medicine,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001;3.Department of Gastroenterology,Baoying County Peoples Hospital of JiangsuProvince,Baoying,Jiangsu,225800)Abstract:Objective To explore the expression of amino acid transporters solute carrier family-1member-5(SLC1A5)in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its correlation with clinico-pathological features,and investigate the potential molecular mechanisms of SLC1A5 in ESCC metasta-sis.Methods The expression of SLCIA5 gene in ESCC and normal tissues was analyzed by TNM plotonline database.The SLCIA5 mRNA expression in ESCC and paracancer tissues was examined byquantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR);the protein expression of SLC1A5 wasdetected by immunohistochemistry(IHC)and the correlations between SLC1A5 and clinic pathologicalcharacteristics in patients were analyzed;SLC1A5 overexpression(SLC1A5-OE group),transmembrance-4收稿日期：2 0 2 3-0 3-13基金项目：国家自然科学基金青年科学基金资助项目（318 0 0 6 7 5）；江苏省自然科学基金面上项目（BK20221373）通信作者：侯思聪，E-mail：s h o u y z u.e d u.c n修回日期：2 0 2 3-0 6 -1634L-six family member-1 overexpression(TM4SF1-OE group),SLC1A5 and TM4SF1 co-overexpressionEcal09 cells were constructed respectively.Cell proliferation test and Transwell test were used todetect the proliferation,migration and invasion ability of Ecal09 cells.The interaction betweenSLC1A5 and TM4SF1 was confirmed by immunoprecipitation(IP)assays;the expression level ofmammalian target of rapamycin(mTOR)signaling pathway-related protein was detected by Westernblot(WB).Results TNM plot database analysis showed that the expression level of SLCIA5 genein the ESCC tissues was significantly higher than that in the normal tissues(P0.05).The expres-sion of SLCIA5 mRNA in ESCC tissues was significantly higher than that in paired para-canceroustissues(P0.05).The results of Transwell experiment showed that compared with the Con group,the cell mi-gration and invasion ability of the SLC1A5-OE group were significantly enhanced(P 5cm），标本收集后,放于-8 0 冰箱保存用于后续研究。本研究通过扬州大学医学院伦理委员会审批。1.2细胞系和细胞培养本研究所使用的 ESCC 细胞系（Eca-109）来自中国科学院细胞库。使用含有10%胎牛血清（FBS)（杭州天杭生物科技股份有限公司，中国）的RMPI-1640培养基培养。HEK293T用无血清培养基DMEM培养。培养条件均为37、5%CO,恒温培养。1.3在线数据库分析使用TNMplot在线数据库（https:/ 1个ESCC 组织和418 个正常组织中SLC1A5基因表达水平。1.4构建过表达质粒TM4SF1的相应过表达质粒来自实验室前期的构建7 。SLC1A5 的全长cDNA是以 Eca-109细胞总cDNA为模板扩增得到,然后亚克隆到pDONR201载体中。随后通过Gateway技术将SLC1A5的cDNA从pDONR201载体中置换到pLenti-CMV-Puro DEST（w l 18-1）（A d d g e n e，#17452）或 pLenti-CMV-Hygro DEST（w 117-1）（A d d g e n e，#17 454）载体中，从而得到相关慢病毒表达载体。1.5构建病毒包装感染以及稳转细胞系基于慢病毒的TM4SF1或SLC1A5过表达载体与pCAG-HIVgp和pCMV-VSV-G-RSV-Rev共同转染至HEK293T细胞。转染48 h后，收集慢病毒上清液。用所得病毒上清液感染相应细胞7 2 h后，通过潮霉素B或嘌呤霉素对细胞进行筛选，最终获得相应抗性的稳转细胞系。1.6IHC取石蜡包埋的标本切片，将组织切片脱蜡和水化,进行高压抗原修复，SLC1A5一抗（CST，美国，货号#8 0 57，稀释比例1:150）在4冰箱孵育过夜，二抗工作液37 孵育30 min，3，3-二氮基联苯胺盐酸盐（DAB)显色和苏木素复染,最后脱水、透明、封片。SLC1A5染色结果判读方法如下：阳性细胞数的百分比分5个等级，即0 分(0%）、1 分(0%2 5%）、2 分（2 5%50%)、3分（50%7 5%）、4分（7 5%10 0%）；染色强度分4个等级，即0 分（无色）、1分（淡黄色）、2分（棕黄色）、3分（棕色或棕褐色）；最终染色分实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice数=染色强度分数阳性细胞百分比分数。0 3分为低表达，412 分为高表达。1.7实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)采用TRIzol试剂（Invitrogen,美国）从组织中提取总RNA,按照制造商说明，使用iScriptcDNA合成试剂盒（Bio-Rad，美国）对分离的RNA进行逆转录，采用 iTaq Universal SYBR Green Kit（Bi o-Ra d，美国）进行qRT-PCR。以GAPDH为内参基因进行分析。相关引物序列见表1。表1qRT-PCR相关的引物序列基因序列SLC1A5正向5-TCGTCGAGATCGAGGATGTG-3反向5-GGAACTGGAAGAGGTCCCAA-3GAPDH正向5-GGAGTCAACGGATTTGGT-3反向5-GTGATGGGATTTCCATTGAT-31.8蛋白质免疫印迹(WB)从收获的细胞中提取总蛋白,用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，美国）测定蛋白浓度,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（伯乐系统，美国）分离并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）（Si g m