不同花色类型蜡梅花被片靶向类黄酮代谢组学分析.pdf

DOI:10.12403/j.1001-1498.20220537不同花色类型蜡梅花被片靶向类黄酮代谢组学分析沈植国1,2*，程建明2,3，武方方3，丁鑫1,2(1.河南省林业科学研究院，河南郑州450008；2.蜡梅国家创新联盟，河南郑州450008；3.河南卡乐夫园艺有限公司，河南郑州450000)摘要：目的 以初花期的红花蜡梅、红心蜡梅、素心蜡梅的中、内花被片为材料，开展靶向类黄酮代谢组检测与分析，为进一步解析不同花色类型蜡梅花被片的呈色物质及类黄酮代谢途径提供参考。方法 对蜡梅 3 个品种的中、内花被片进行 UPLC-MS/MS 检测，并进行代谢物定性定量分析、样本质控分析、PCA 分析、HCA 分析、OPLS-DA 分析及差异代谢物 KEGG 功能注释与富集分析，探究不同花色类型花被片间类黄酮代谢物差异。结果 在蜡梅花被片中共检测到 82 种代谢物，包括查耳酮、二氢黄酮、黄酮、异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮醇、花青苷、黄烷醇等化合物；蜡梅红色花被片类黄酮物质除花青苷类外，还包括黄酮醇类化合物，其在红、黄花被片中未显示出规律性变化；花青素代谢通路富集程度在蜡梅红、黄花被片 5 个比较组中均表现为最大且最显著。结论 蜡梅花被片类黄酮生物合成途径中除主要的黄酮醇支路和花青素支路外，还可能包括黄酮支路、异黄酮支路和黄烷醇支路；在蜡梅花被片类黄酮生物合成途径中，花青素支路和黄酮醇支路可能不是对共同底物的竞争关系；矢车菊苷是蜡梅花被片呈红色的特征代谢物，包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷。关键词：蜡梅；花被片；类黄酮；代谢物中图分类号：S718.43文献标识码：A文章编号：1001-1498(2023)04-0082-08类黄酮（flavonoids）是植物一类重要的次生代谢产物，在植物器官中普遍存在1。许多类黄酮物质具有清除自由基、抗氧化、预防冠心病、保肝、抗炎、抗癌等活性，部分类黄酮还具有潜在的抗病毒活性。在植物中，类黄酮不仅可以改变花色，在植物的抗逆境反应上有着重要功能，还可以在抑制昆虫取食和植物与微生物的相互作用中发挥作用2。此外，类黄酮有助于对抗氧化应激，并作为生长调节剂促进植物生长3。大多数花、水果和种子着色的色素是类黄酮化合物4-5。类黄酮通过苯丙氨酸途径合成，苯丙氨酸转化为 4-香豆素辅酶 A，进入类黄酮生物合成途径6，首先合成的前体物质二氢黄酮通过不同的分支代谢途径，可分别生成黄酮（flavones）、异黄酮（isoflavones）、黄酮醇（flavonols）、花色素（anthocyanins）和黄烷醇（flavanols）等代谢物。蜡梅花被片中的类黄酮物质主要为黄酮醇和花青苷类化合物7-9，但现有研究中，关于蜡梅花被片类黄酮物质检测的种类较少，花被片类黄酮代谢途径的中间产物及其他支路代谢物也鲜见报道。蜡收稿日期：2022-11-10修回日期：2023-02-17基金项目：河南省重点研发专项（项目编号：221111110700）；河南省农业科学院科技创新团队“特色花木种质创新与利用”项目（项目编号：2023TD35）；河南省科技兴林项目（文件号：豫财环资 202228 号）；河南省基本业务费项目（项目编号：2021JB01001、2022JB02001）*通讯作者:沈植国，博士，正高级工程师。主要研究方向：特色花木与经济林遗传育种及高效培育。电话：0371-632103129。Email：2023，36（4）：82-89林业科学研究http:/Forest Research梅以内花被片颜色分为素心品种群(ConcolorGroup)、晕心品种群(IntermediusGroup)以及红心品种群(PatensGroup)10，同时，红花蜡梅新品种鸿运中花被片大多数为紫红色，伴有极少数红黄色中花被片，系首次发现的中花被片为红色的蜡梅品种11，作为新花色类型，其嫩梢挥发性成分已开展过相关研究12，而花被片类黄酮代谢成分与传统品种的差异尚不清楚。本研究以分别代表不同花色类型的红花蜡梅、红心蜡梅、素心蜡梅 3 个栽培品种鸿运蜡梅（C.praecox Hongyun）、豫 香 蜡 梅（C.praecox Yuxiang）、鄢 陵 素 心 蜡 梅（C.praecoxYanlingsuxin）初花期花朵为材料，将中、内花被片分开取样，基于超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，开展靶向类黄酮检测，分析不同花色类型花被片类黄酮物质差异，并进行功能注释与代谢通路分析，为解析不同花色类型蜡梅花被片呈色物质及类黄酮代谢途径提供参考。1材料与方法1.1实验材料采集红花蜡梅（中、内花被片均为红色）、红心蜡梅（中花被片黄色、内花被片红色）、素心蜡梅（中、内花被片均为黄色）3 个品种初花期花朵（图 1），及时将中、内花被片分开取样，液氮处理后放入80 冰箱保存。3 个品种 6 个处理，每个处理 3 个重复，共计 18 个样。样品信息见表 1。1.2样品提取将真空冷冻干燥的花被片研磨至粉末状（研磨仪型号：MM400，Retsch，参数：30Hz，1.5min）；称取 100mg 粉末溶解于 1.0mL70%的甲醇水溶液中，置于 4 条件下过夜；离心取上清（转速 10000g，10min），微孔滤膜过滤（孔径 0.22m），用于后续分析。1.3色谱质谱采集条件按照高渐飞等检测黑老虎果实营养成分的条件13。1.4代谢物定性与定量利用质谱的一级谱和二级谱，基于相关代谢物数据库进行定性分析14。利用三重四级杆的质谱多反应监测（MRM）进行定量分析，首先筛选目标物质的母离子，经碰撞室诱导电离后形成碎片离子，由三重四级杆过滤出特征碎片离子，获得不同样本的代谢物质谱峰，并对同一代谢物在不同样本中的质谱峰进行峰面积积分校正15。1.5信息分析流程包括数据前处理、统计分析及功能分析。其中数据前处理包括代谢物定性定量分析、样本质控分析、主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）；数据合格后进行统计分析，包括正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）、差异倍数分析（FoldChange）等；筛选出差异代谢物后进行差异代谢物功能注释和代谢通路分析。2结果与分析2.1代谢物定性定量分析经分析，本实验中共检测到 82 种代谢物，包括 2 种查耳酮、7 种二氢黄酮、14 种黄酮、2 种异黄酮、6 种二氢黄酮醇、41 种黄酮醇、7 种花青苷、3 种黄烷醇，其中主要成分为槲皮素类的黄酮醇及黄酮化合物。按照植物类黄酮主要合成途径，花被片代谢物中的芦丁等黄酮醇类化合物属黄酮醇支路；矢车菊素 3-O-葡萄糖苷等花青苷类化合物属花青素支路；表儿茶素等黄烷醇类物质属黄烷醇支路；五羟黄酮等黄酮类物质属黄酮支路；异黄酮红花蜡梅RW初花期Early flowering period盛花期Full flowering period红心蜡梅PW素心蜡梅CW图1红花蜡梅、红心蜡梅、素心蜡梅初花期及盛花期表型Fig.1PhenotypeofflowersofRubrum,Patens,andConcolorwintersweet(RW,PW,andCW)attheearlyandfullfloweringstage表1样品编号信息Table1Samplenumberinformation花色类型Flowercolortypes组织部位Tissue样本名称Samplename红花蜡梅（RW）中花被片RWM-1、2、3内花被片RWI-1、2、3红心蜡梅（PW）中花被片PWM-1、2、3内花被片PWI-1、2、3素心蜡梅（CW）中花被片CWM-1、2、3内花被片CWI-1、2、3第4期沈植国，等：不同花色类型蜡梅花被片靶向类黄酮代谢组学分析83类化合物属异黄酮支路。其中查耳酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇是植物类黄酮生物合成途径的中间产物。根据代谢物种类，表明蜡梅花被片类黄酮合成途径中几种主要支路可能均含有。2.2样本质控分析在仪器分析的过程中，每 10 个检测样本中插入一个由样本提取物混合制备而成的质控（QualityControl,QC）样本，以监测分析过程的重复性。QC 样 本 质 谱 检 测 总 离 子 流 图（Total ionchromatogram,TIC)的叠加图（图 2）表明：仪器重复性较好。2.7e72.6e72.5e72.4e72.3e72.2e72.1e72.0e71.9e71.8e71.7e71.6e71.5e71.4e71.3e71.2e71.1e71.0e79.0e68.0e67.0e66.0e65.0e64.0e63.0e62.0e601.0e60.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0时间 Time/分 min2.212.572.853.733.894.225.786.803.6e73.4e73.2e73.0e72.8e72.6e72.4e72.2e72.0e71.8e71.6e71.4e71.2e71.0e78.0e66.0e64.0e62.0e601.02.03.02.602.863.413.744.234.414.585.235.374.05.06.07.08.09.010.011.012.013.0强度 Intensity/cps强度 Intensity/cps时间 Time/min图2QC 样本检测 TIC 的叠加图（正、负离子模式）Fig.2TICsuperpositiondiagramofQCsamplesdetected(positiveandnegativeionmode)2.3样品主成分分析与聚类分析PCA 分析可显示各组分离趋势及组间是否存在差异16，样品 PCA 见图 3。R 软件（www.r-project.org/）对不同样本的 HCA 见图 4。PCA 和HCA 可初步了解组间的差异和组内的变异度大小，图中 18 个样本被清晰地分为 6 组，同组内3 个样品被聚到一起，表明样品重复性好，组内具有一致性，相距较近；组间具有差异性，相距较远。2.4差异代谢物分组正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）为深入研究红、黄花被片代谢物差异，将 6 个处理分为 5 个比较组，分别为 PWMvsPWI、PWM vs RWM、CWI vs PWI、CWI vs RWI、CWMvsRWM。根据 OPLS-DA 模型进一步展示各分组间代谢物差异17。5 个比较组的 OPLS-DA 得分见图 5。依据变量投影重要度（VariableImportanceintheprojection,VIP 值，即差异代谢物在样本分类判别中的影响强度）可对差异代谢物进行分析和筛选。2.5差异代谢物筛选不同处理间的差异代谢物可基于 OPLS-DA 获得的 VIP 值进行初步筛选，同时结合单变量分析5051050510PC2(17.36%)PC1(50.55%)GroupCWMCWIPWMPWIRWMRWIMIX864202410642024685051015PC3(12.97%)PC1(50.55%)PC2(17.36%)CWMCWIPWMPWIRWMRWIMIX2D PCA Plot图3样品质谱数据的 PCA 得分图（MIX 为质控样本）Fig.3PCAscoreofsamplesmassspectrometrydata(MIXarethequalitycontrolsamples)84林业科学研究第36卷的差异倍数或 P 值进一步筛选。筛选标准为：差异倍数2 及0.5 的代谢物；对生物学重复样品在上述差异倍数基础上，选取 VIP1 的代谢物。统计各分组差异代谢物数量（表 2），通过维恩图可展示各组差异代谢物之间的关系（图 6）。根据差异代谢物筛选结果，以上 5 组共有差异代谢物分别为：矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-芸香糖苷、矢车菊素3-O-半乳糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（21）-葡萄糖醛酸苷4 种，均表现为在红色花被片中含量高。4