X射线辐照对淋巴细胞的灭活能力及对悬浮红细胞质量的影响研究.pdf

J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3320DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.006作者单位：100071 解放军总医院第五医学中心作者简介：陈怡静，主要从事临床输血研究，（E-mail）。通信作者：骆群，主任医师，博士，主要从事临床输血研究，（E-mail）。论著X射线辐照对淋巴细胞的灭活能力及对悬浮红细胞质量的影响研究陈怡静 卓海龙 张怡 程晨 骆群 【摘要】目的 探讨X射线辐照对悬浮红细胞中淋巴细胞灭活能力及辐照后14 d内对红细胞质量的影响。方法 将悬浮红细胞分为三组：X射线辐照组、射线辐照组、未辐照组，辐照组分别使用X射线辐照仪、射线辐照仪以25 Gy剂量辐照。分离上述三组悬浮红细胞的淋巴细胞进行培养，比较两种辐照方法对悬浮红细胞中淋巴细胞的灭活效果；检测辐照后第0、7、14 d悬浮红细胞的溶血率、2,3DPG、ATP、红细胞渗透脆性等。结果 X射线辐照、射线辐照后淋巴细胞增殖抑制率分别为（98.0341.778）%和（97.8821.915）%，且两组在辐照后14 d内溶血率、2,3DPG、ATP、红细胞渗透脆性等差异均无统计学意义（P0.05）。结论 X射线血液辐照仪和射线辐照仪对淋巴细胞的灭活效果无明显差异，且25 Gy辐照对悬浮红细胞质量无明显影响。【关键词】X射线 射线 悬浮红细胞 淋巴细胞 输血相关移植物抗宿主病 【中图分类号】R457 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0320-04Effect of X-ray Irradiation on the Inactivation Ability of Lymphocytes and the Quality of Suspended Blood Cells CHEN Yijing,ZHUO Hailong,ZHANG Yi,et al.The Fifth Medical Center of PLA General Hospital,Beijing 100071【Abstract】Objective To investigate the effect of X-ray irradiation on the inactivation ability of lymphocytes in suspended red blood cells and the quality of red blood cells within 14 days after irradiation.Methods The suspended red blood cells were divided into three groups:X-ray irradiation group,-ray irradiation group and non-irradiation group.The irradiation group was irradiated with 25Gy X-ray and-ray irradiation instrument respectively.Lymphocytes from the three groups of suspended red blood cells were isolated and cultured to compare the inactivation effects of the two irradiation methods on lymphocytes in suspended red blood cells.The hemolysis rate,2,3-DPG,ATP and osmotic fragility of red blood cells at 0,7 and 14 days before and after irradiation were detected.Results The inhibitory rates of lymphocyte proliferation after X-ray irradiation and-ray irradiation were(98.0341.778)%and(97.8821.915)%respectively,and there were no significant differences in hemolysis rate,2,3-DPG,ATP and osmotic fragility of erythrocytes between the two groups within 14 days after irradiation(P0.05).Conclusion There is no significant difference in the inactivation effect of lymphocyte between X-ray and-ray irradiation,and 25Gy irradiation has no significant effect on the quality of suspended red blood cells.【Key words】X-rays -rays Suspended red blood cells Lymphocytes Transfusion-associated Graft-versus-host disease在输血过程中，血液制品中含有免疫活性的T淋巴细胞不能被受者免疫系统识别和排斥，在受者体内增殖进而攻击和破坏受者细胞和组织而引起的免疫学反应，称为输血相关的移植物抗宿主病（transfusion-associated graft-versus-host disease，TA-GVHD），其发生率低（约0.01%0.1%），但病死率高（80%90%）1。TA-GVHD多发生于免疫抑制的患者，如先天性T细胞免疫缺陷及联合免疫缺陷者、接受或尚未接受化疗的血液系统肿瘤。对血液制品进行去白、辐照是目前预防其发生的重要手段。目前我国常用的辐照仪类型为射线辐照仪，通常采用放射性同位素钴60（60Co）或铯137（137Cs）作为永久放射源（属于二类放射性物质），受到国家严格监管，其危险程度和维护成本均较高。X射线在临床应用非常广泛，相对于射线在管理和应用方面更为安全，但我国目前对于X射线血液辐照仪的临床研究甚少报导。本次研究通过溶血率、2,3DPG、ATP、红细胞渗透脆性等指标监测辐照后红细胞功能，比较X射线和射线辐照悬浮红细胞对淋巴细胞增殖抑制率及悬浮红细胞质量的影响。材料与方法1 仪器与试剂 X射线血液辐照仪（青岛金成源JCYBRI7000/8000），射线血液辐照仪（中国核动力研究院，HXFS-IA，放射源：137Cs），全自动血液分析仪（希森美康XS-800i），半自动生化分析仪（ROBERT，photometer 4040），ATP荧光检临床输血与检验2023年6月第25卷第3期321测仪（3M Clean-Trace NG3），muse计数仪（德国默克密理博），多功能酶标仪（PerkinElmer-v e c t o r X4），无 菌 接 管 机（德 国 费 森 尤 斯COMPODOCK），游离血红蛋白检测试剂盒（北京瑞尔达公司，批号：210114），2，3-DPG检测试剂盒（BIOSWAMP，批号：202106），Clean-Trace 采样棒（3M，批号：21013203），PRMI-1640（Solarbio，20210310），IL-2 1000 IU/mL（北京同立海源，批号：1042006020100），CD3 400 ng/mL（北京同立海源，批号1012007290500），C C K-8（日 本 同 仁 化 学 株 式 会 社，批 号：PM508），淋巴细胞分离液（天津灏洋，批号：202011068540）。2 悬浮红细胞制备及辐照 本研究已获医院伦理审批同意，已征求献血者知情同意，并签署知情同意书。选择健康献血员20名，征其同意并签署知情同意书后，三联袋采集全血400 mL。将采集的新鲜全血（400 mL，CPDA保存液）以3 500g、离心15 min，温度4，离心后分上层血浆至2号转移袋，将悬浮红细胞无菌条件下分装成三袋，设为未辐照组、X射线辐照组和射线辐照组，将辐照组血放入辐照仪中25 Gy辐照后4 保存。3 淋巴细胞分离培养 分别经无菌接合取实验组、对照组、未辐照组红细胞8 mL，Ficoll-Hapaque密度梯度离心（400g离心30 min后吸取淋巴细胞，800g离心5 min生理盐水洗涤三遍），用500 L 1640培养基（已加入自体补体灭活血浆10%、IL-2 1 000 IU/mL、CD3 400 ng/mL）重悬，计数后继续用1640培养液调整细胞浓度为1.0106，向25 cm2培养瓶中加入1640培养基4 mL，细胞悬液1 mL，放入37、5%CO2培养箱中培养7 d。4 淋巴细胞增殖抑制率 将培养好的细胞接种至96孔板，每份细胞重复3个孔，3个空白孔，每孔加样100 L，再加入10 L CCK8试剂，混匀，37、5%CO2培养箱中培养4 h后酶标仪检测OD450值，计算淋巴细胞增殖抑制率。5 血浆游离血红蛋白测定 使用血浆游离血红蛋白测定试剂盒测定上清中游离血红蛋白，设定空白管（生理盐水100 L）、标准管（血红蛋白标准液100 L）、测定管（悬浮红离心后上清100 L），按照操作说明分别在各管中加R1液、R2液各1 mL、R3液100 L混匀，37 反应20 min后用半自动生化分析仪于波长505 nm处测定游离血红蛋白含量。6 红细胞常规检测 用西森美康全自动血液分析仪XS-800i进行血常规检测。7 悬浮红细胞2，3-DPG测定 取1 mL悬浮红细胞2 500 r/min，4离心10 min，弃上清，用高氯酸（0.6 mol/L）沉淀血红蛋白，2.5 mol/L碳酸钾去除高氯酸盐沉淀，取上清稀释后按试剂说明书进行检测。8 统计学方法 应用SPSS统计软件进行统计学处理，计量数据用均数标准差表示，淋巴细胞增殖抑制率两组间均数采用配对样本t检验比较，三组间比较采用方差分析，P0.05表示差异具有统计学意义。结 果1 淋巴细胞增殖抑制率 悬浮红细胞经辐照后淋巴细胞增殖明显受抑，X射线辐照组淋巴细胞增殖抑制率为（98.0341.778）%，射线辐照组淋巴细胞抑制率为（97.8821.915）%，两组效果无明显差异（P0.05），见表1。2 溶血率 0 d14 d三组间溶血率均无明显差异（F3.159，P0.05），辐照后红细胞溶血率略有上升，但均符合质量要求，溶血率0.800%，见表2。3 红细胞渗透脆性 红细胞渗透脆性的影响随保存时表1 X、射线辐照后增殖抑制率结果（n=20）未辐照X射线辐照组射线辐照组OD值1.4610.2680.0270.0360.0320.032增殖抑制率（%）98.0341.77897.8821.915注：X射线辐照组与射线辐照组OD值进行配对t检验：t值为0.567，P值为0.577；X射线辐照组与射线辐照组增殖抑制率进行配对t检验：t值为0.298，P值为0.769。增殖抑制率=（Ac-As）/（Ac-Ab）100%，As：实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、辐照后），Ac：对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、未经辐照），Ab：空白孔（不含细胞的培养基、CCK-8）。表2 未辐照组、X、射线辐照组溶血率结果（n=20）未辐照X射线辐照组射线辐照组F值P值0 d（%）0.0490.0350.0570.0360.0480.0420.3270.7227 d（%）0.0490.0260.0550.0220.0500.0190.4420.64514 d（%）0.0660.0240.0700.0250