rAAV5阴离子交换层析工艺的开发.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.107rAAV5 阴离子交换层析工艺的开发许 琳1,梁欢欢1,李红英2,韩 旭2,戴柳冰2,马 超2,朱 涛1,2(1.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457;2.康希诺生物股份公司,天津 300000)摘 要 建立一种有效提高重组 5 型腺相关病毒(rAAV5)实心载体比率的阴离子交换层析的纯化方法。对亲和层析捕获的 rAAV5 样品,使用多种阴离子交换层析柱进行离子强度线性梯度洗脱,CIMmultus QA(CIMQ)层析柱能够有效分离不含目的基因组的病毒(病毒空颗粒)和含目的基因组的病毒(实心载体)。基于 CIMQ 层析柱,进行纯化缓冲液体系、紫外目标峰收集范围的优化。通过 qPCR 检测病毒基因组(Vg)含量计算回收率,高效液相色谱法(HPLC)或体积排阻色谱-多角度静态光散射技术(SEC-MALS)测定实心载体比率。使用 Tris,Na2HPO4,pH 8.0 缓冲体系,洗脱时收集紫外吸收值 UV260/UV280比值大于 1 的部分,收集的样品实心载体比率达到 80.3%。成功建立一种简单方便的阴离子交换层析方法,能去除 rAAV5 样品中的病毒空颗粒,使实心载体比率达到基因治疗临床产品要求。关键词 rAAV5;阴离子交换层析;实心载体比率;回收率;纯化中图分类号 TQ425文献标识码 B文章编号 2095-1736(2023)04-0107-07Development of rAAV5 anion exchange chromatography processXU Lin1,LIANG Huanhuan1,LI Hongying2,HAN Xu2,DAI Liubing2,MA Chao2,ZHU Tao1,2 1.College of Bioengineering Tianjin University of Science and Technology Tianjin 300457 China 2.Cansino Biologics Inc.Tianjin 300000 China Abstract A purification method was established for effectively increasing the proportion between vector capsids of rAAV5-a viral prod-uct containing the therapeutic DNA sequence and empty capsids viral vectors lacking the therapeutic gene.For the rAAV5 samples obtained from affinity chromatography several anion exchange chromatography and related gradient elution methods were tested in which CIMmultus QA CIMQ can effectively remove empty capsids from vector capsids.For the CIMQ purification the buffer matrix and the collection of rAAV5 fractions were optimized.Subsequently qPCR was used to quantify the recovery rate of the virus genome Vg content and high-performance liquid chromatography HPLC or size exclusion chromatography-multi-angle static light scattering SEC-MALS was used to determine the vector capsids proportion of rAAV5 samples.In the CIMQ purification process the proportion of vector capsids in the collected fraction at UV absorbance UV260/UV280 greater than 1 eluted with Tris-Na2HPO4 buffer at pH 8.0 reached 80.3%.A simple and convenient method using anion exchange chromatography was successfully established which can effec-tively eliminate empty capsids of rAAV5 from vector capsids so that vector capsids proportion can meet the requirements of clinical ap-plication of gene therapy.Keywords rAAV5 anion exchange chromatography vector capsids proportion recovery purification腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)最早于 20 世 纪 60 年 代 在 实 验 室 腺 病 毒 制 剂 中 发现1-2,随后不久在人体中发现3。AAV 是一类无包膜、直径 20 26 nm 的二十面体结构,含有 4.7 kb的单链 DNA 基因组,属于细小病毒家族4-6。由于其安全性好、宿主范围广(分裂和非分裂细胞)、物理性质稳定,并且感染人体后不会导致任何生理或病理变化而成为基因治疗最具应用前景的载体之一7-8。目前,以 AAV 为载体成功用于临床基因治疗的药物有 3 种,即 Glybera(AAV1)、Luxturna(AAV2)701第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-05-10;最后修回日期:2022-08-17基金项目:天津市自然科学基金项目(No.18JCQNJC09700)作者简介:许琳,硕士研究生,研究方向为基因治疗,E-mail:通信作者:朱涛,博士,教授,研究方向为疫苗及其他生物制品的开发,E-mail:tao.zhu 和 Zolgensma(AAV9)。不同的 AAV 血清型具有不同的组织趋向性,已被证明在肺、肌肉、大脑、脊髓、视网膜和肝脏等多种组织中可以进行长期有效的表达9-10。基因治疗产品的质量对临床药物的安全性至关重要。使用三质粒转染人胚肾细胞(HEK293)时,病毒包装成实心载体的过程往往是低效的,导致在生产制备过程中形成缺乏载体基因组的空颗粒11-12,病毒空颗粒被认为是最难以去除的杂质。Gao 等13研究表明去除 AAV 制剂中的病毒空颗粒会提高 AAV 在临床应用中的治疗效果和安全性。使用氯化铯梯度超速离心法纯化的 AAV 载体已被用于一些临床试验中,然而这些纯化方法并不容易工艺放大14。最近阴离子交换层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析被报道用于分离病毒空颗粒,然而这些方法主要是针对 AAV1-6、AAV8和 AAV915-17。本研究使用亲和捕获后的 rAAV5 样品,进行层析填料与层析柱的筛选,根据筛选结果作进一步纯化体系和方法的优化。最终可以得到符合产品质量要求的病毒载体,为 rAAV5 载体工业生产放大提供了一种方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒载体采用三质粒共转染的方式进行上游发酵,收获的发酵液需粗纯(裂解,酶解与澄清)去除杂质,然后进行亲和层析,但是亲和层析捕获的 rAAV5 样品中仍然含有大量的病毒空颗粒(一般在 70%95%),需进一步进行精纯优化,使得样品符合质量要求(实心载体比率大于 70%)。1.1.2 填料与层析柱 SOURCE 30Q(Cytiva 公司);Q ImpRes(Cytiva 公司);NanoQ-30L(苏州纳微科技有限公司);MC30-Q(苏州赛分科技股份有限公司);CIMmultus QA 层析柱(BIA Separations 公司);CIMQ AAV full/empty 0.1 mL analytical column(BIA Separations 公司)。1.1.3 主要仪器与试剂AKTA avant 150 层析系统(Cytiva 公司);新型 XP Cycler PCR 基因扩增仪(杭州博日科技股份有限公司);QuantStudio 3 荧光定量 PCR 仪(Thermo 公司);al-liance e2695 高效液相色谱仪(Waters 公司);Optilab 示差折光仪(Wyatt 公司);DAWN 18 角度静态光散射仪(Wyatt 公司);JEM-2010FEF 场发射透射电子显微镜(JEOL 公司);Elx808 酶标仪(BioTek 公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris,Angus Chemical Company);Bis-Tris propane(BTP,BBI);NaCl(天津市海光药业有限公司);Na2HPO4(天津市科密欧化学试剂有限公司);NaAC(四川金山制药有限公司);AAVpro Titration kit(for Real Time PCR)(TaKaRa 公 司);resDNASEQ Quantitative Human DNA Kit(Thermo 公司);PrepSEQTM Nucleic Acid Extraction Kit(Thermo 公司);PrepSEQTM Residual DNA Samplle Perparation kit(Thermo 公司);HEK 宿主细胞蛋白检测试剂盒(Cygnus Technologies公司)。1.2 方法1.2.1 阴离子交换层析柱筛选缓冲液配制:A 液:20 mmol/L Tris,pH 9.0;B 液:20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH 9.0。使用直径约 16 mm 柱管,对 SOURCE 30Q、Q ImpRes、NanoQ-30L、MC30-Q 等 4 种阴离子层析填料进行装柱,高度均为 0.8 cm,CIMQ 为 1 mL 阴离子交换层析柱。层析过程:(1)平衡:90%A 液,10%B 液,流速 4 mL/min 进行柱平衡;(2)上样:流速 4 mL/min;(3)再平衡:90%A液,10%B 液,流速 4 mL/min 进行柱平衡;(4)洗脱:10%100%B 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速 4 mL/min;(5)清洗:2 mol/L NaCl,流速4 mL/min,进行柱清洗。根据病毒基因组(Vg)含量和实心载体比率检测结果,初步筛选出表现良好的阴离子交换层析柱。1.2.2 CIMQ 层析柱工艺优化(1)纯化缓冲体系的筛选。使用 UNICORN 7.6 软件中的交互过程模型,采用全因子混合设计方案,根据不同缓冲体系,设计方案包含 2 个中心点(实验编号7、8),8 个实验,筛选出重要的影响因素,实验方案见表 1。表1 中缓冲体系的配制:Na2HPO4缓冲体系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L Na2HPO4,B 液:10 mmol/L BTP,65 mmol/L Na2HPO4;NaAC 缓 冲 体 系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L NaAC,B 液:10 mmol/L BTP,185 mmol/L NaAC;NaC