VDAC1通过诱导气道上皮细胞铁死亡参与屋尘螨诱导的哮喘小鼠气道炎症.pdf

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性（AHR）为特征的炎症性疾病，表现为反复发作的喘息、呼吸困难、咳嗽或胸闷。目前认为其发病机制由遗传、环境。人体免疫等多个方面相关，在临床上哮喘分为多种表型 1，而在哮喘的所有表型中，都会出现了上皮损伤这一病理特征 2。提示气道上皮与哮喘密切相关，深入探讨气道上皮对哮喘的发生发展具有重要意义。线粒体是细胞内重要的细胞器，是细胞多种代谢反应的中心，在细胞稳态、代谢、先天免疫、细胞凋亡等方面发挥着至关重要的作用。因此线粒体损伤可影响细胞代谢和能量产生，进而引起一系列代谢紊乱和炎症反应 3。目前认为线粒体功能障碍与肺部疾病的发病机制相关，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）和特发性肺纤维化（IPF）4-6，可造成增殖、凋亡、氧化应激反应、Ca2+稳态破坏和活性氧（ROS）产生增加等影响。不同气道细胞群中的线粒体功能障碍，包括肺泡上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞等，例如刺激上皮细胞衍生的细胞因子导致肌VDVDACAC1 1通过诱导气道上皮细胞铁死亡参与屋尘螨诱导的哮喘通过诱导气道上皮细胞铁死亡参与屋尘螨诱导的哮喘小鼠气道炎小鼠气道炎症症黄 奕，林丽珊，黄浩华，董航明南方医科大学南方医院呼吸与危重症医学科，广东 广州 510515VDAC1 participates in house dust mite-induced asthmatic airway inflammation in miceby inducing ferroptosis of airway epithelial cellsHUANG Yi,Lin Lishan,HUANG Haohua,DONG HangmingDepartment of Respiratory and Critical Care Medicine,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China摘要：目的 探讨电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC1）参与屋尘螨（HDM）诱导的哮喘气道炎症的作用及调控气道上皮细胞铁死亡的机制。方法 人气道上皮细胞（HBE）体外培养，由HDM诱导HBE细胞进行体外实验，浓度梯度刺激24 h，分为正常对照组；200 U刺激组；400U刺激组；800U刺激组。随后使用VDAC1抑制剂VBIT-4干预，分为HBE正常对照组、VBIT-4组（10 mol/L，24 h）、HDM（800 U/mL，24 h）组、HDM（800 U/mL，24 h）+VBIT-4（10 mol/L，24 h）组，测定VDAC1以及铁死亡标志物蛋白的表达水平。使用BALB/c小鼠给予HDM构建哮喘小鼠模型，分为正常对照组、VBIT-4滴鼻组、HDM滴鼻组、HDM+VBIT-4滴鼻组，测定气道炎症水平与铁死亡蛋白的表达水平。结果 通过使用HDM诱导的HBE细胞后，MtROS生成增多，线粒体膜电位下降，免疫印迹试验结果显示VDAC1（P=0.005）表达上调，铁死亡标记物标志物GPX4（P=0.015）表达水平显著降低，FTH1（P=0.030）水平则出现上调；而使用VBIT-4会显著抑制因HDM诱导的FTH1（P=0.037）的表达，并且恢复了GPX4（P=0.029）表达；在HDM诱导的哮喘小鼠模型中，H&E染色和肺泡灌洗细胞计数显示，相较于HDM组，HDM+VBIT-4组的气道炎症细胞浸润减少，炎症细胞数量显著减少（P=0.0002）；瑞氏-姬萨姆染色也表明VBIT-4减少了肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞的数量（P=0.001）免疫组织化学染色显示气道上皮细胞GPX4表达在VBIT-4干预下上调。结论 VDAC1参与HDM诱导的支气管哮喘的慢性气道炎症，可能通过引起铁死亡实现的。关键词：哮喘；铁死亡；线粒体；VDAC1Abstract:Objective To investigate the role of voltage-dependent anion-selective channel protein 1(VDAC1)in house dust mite(HDM)-induced asthmatic airway inflammation and its mechanism for regulating ferroptosis in airway epithelial cells.Methods Human airway epithelial(HBE)cells were exposed to a concentration gradient(200,400 and 800 U)of HDM alone orin combination with treatment with 10 mol/L VBIT-4(a VDAC1 inhibitor)for 24 h,and the expressions of VDAC1 andferroptosis-associated proteins in the cells were examined.Adult male BALB/c mice were treated with intranasal instillation ofVBIT-4,HDM,or both,and the level of airway inflammation and the expressions of ferroptosis-associated proteins weredetected with immunohistochemistry.Results In HBE cells,HDM exposure caused a significant increase of mitochondrial ROS(mtROS)production and obviously decreased the mitochondrial membrane potential.The exposed cells showed obviouslyincreased protein expressions of VDAC1(P=0.005)and FTH1(P=0.030)but decreased protein expression of GPX4(P=0.015)and FTH1(P=0.037),while the treatment with VBIT-4 repressed the expression of GPX4(P=0.001)and inhibited the expressionof VDAC1.In BALB/c mice,treatment with VBIT-4 significantly improved HDM-induced airway inflammation by reducingthe number of inflammatory cells(P=0.029)in the airway and the number of eosinophils in the alveolar lavage fluid.Immunohistochemical staining showed that GPX4 expression in the airway epithelial cells was significantly increased aftertreatment with VBIT-4.Conclusions VDAC1 participates in HDM-induced chronic airway inflammation in bronchial asthmaby causing ferroptosis of the airway epithelial cells.Keywords:asthma;ferroptosis;mitochondria;voltage-dependent anion-selective channel protein 1收稿日期：2023-03-17基金项目：国家自然科学基金（82170032）Supported by National Natural Science Foundation of China(82170032).作者简介：黄 奕，硕士研究生，E-mail:通信作者：董航明，主任医师，博士生导师，E-mail:J South Med Univ,2023,43(8):1333-1338doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.08.091333成纤维细胞的激活，从而促进成纤维过程 7，但线粒体与哮喘的相关研究较少。为了更好地了解线粒体在哮喘中的作用并开发新的治疗策略，有必要进一步的进行研究。电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC1）是是锚定线粒体外膜上的多功能蛋白，它可以调控线粒体与细胞其他组分之间的物质代谢，维持细胞的生理功能；而在调节能量产生、线粒体氧化酶应激、Ca2+运输、物质代谢等方面，VDAC1同样参与其中 8。当细胞受到外界刺激时，VDAC1还可通过与Bax结合，参与细胞凋亡的调节 9；因此VDAC1与线粒体功能息息相关，但近年来，有研究指出，在香烟烟雾、空气污染、炎症因素、缺氧等因素刺激下，VDAC1可发生寡聚化释放损伤相关分子模式从而引起炎症反应，参与慢性炎症疾病的发生发展 10-12，而哮喘作为全身性的慢性炎症疾病，我们认为VDAC1参与了哮喘气道炎症的发生。铁死亡是一种程序性的细胞死亡形式，本质是铁依赖的脂质过氧化过程，与神经退行性变、缺血再灌注、癌症等疾病有关 13-15。在正常情况下，胱氨酸的正常运输保护细胞免受脂质过氧化和抑制铁死亡 16。在不同疾病模型的铁死亡过程中都可以观测到线粒体功能受损，活性氧（ROS）增多、膜电位（MMP）改变、脂质过氧化加剧和线粒体内铁的积累都证明了这一点 17,18。然而，对于目前铁死亡与线粒体之间的调控作用与关系尚不明确 19。本研究旨在探讨HDM诱导的气道上皮细胞细胞是否通过调控VDAC1引起线粒体功能障碍从而引起铁死亡，以进一步揭示哮喘的发生机制并为哮喘的精准治疗提供新的治疗靶点。1 材料和方法1.1 材料人气道上皮细胞株（HBE细胞，ATCC）；角质细胞培养基（KM培养基，ScienCell）；胎牛血清（GIBCO）；屋尘螨制剂（HDM，ALK-Abello）；VBIT-4（Selleckchem）；线粒体红色荧光探针（Mito-Tracker Red），Hoechst33342活细胞染色液（碧云天）；苏木素染液，伊红染液，瑞氏-姬萨姆复合染液（索莱宝）；免疫组化兔二步法 检测试剂盒（中国北京中杉金桥生物技术有限公司）；兔抗VDAC1 单 克 隆 抗 体，鼠 抗-acitn 多 克 隆 抗 体（Proteintech）；兔抗谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）单克隆抗体（abcam），兔抗铁蛋白重链1（FTH1）多克隆抗体；驴抗兔红外二抗（Licor）。1.2 方法1.2.1 细胞培养HBE 细胞使用 KM 培养基进行培养。HDM浓度梯度刺激分组如下：对照组；200 U刺激组组：用 HDM（800 U/mL）处理 24 h；400 U刺激组：用HDM（800 U/mL）处理 24 h；800U刺激组组：用 HDM（800 U/mL）处理24 h。VBIT-4分组处理如下：对照组；HDM组：用HDM（800 U/mL）处理24 h；VBIT-4组：用VBIT-4（10 mol/L）处理24 h；HDM+VBIT-4组：HDM（800 U/mL）与VBIT-4联合处理24 h；每天更换KM培养基。1.2.2 细胞线粒体膜电位测定 将HBE细胞传代铺于小皿中，按照实验设计进行处理后加入200 LJC-1染色工作液（1 200）在37 敷箱避光孵育20 min，PBS清洗后使用荧光显微镜