TMEM64在肝癌组织中高表达并促进肝癌细胞的增殖和侵袭.pdf

TMEMTMEM6464在肝癌组织中高表达并促进肝癌细胞的增殖和侵袭在肝癌组织中高表达并促进肝癌细胞的增殖和侵袭曹丹萍1，蔡 娟2，李艳娜1，董润雨1，王智雄1，左学良1皖南医学院第一附属医院/弋矶山医院1胃肠外科，2肿瘤内科，安徽 芜湖 241001TMEM64 is highly expressed in hepatocellular carcinoma and promotes tumor cellproliferation and invasionCAO Danping1,CAI Juan2,LI Yanna1,DONG Runyu1,WANG Zhixiong1,ZUO Xueliang11Department of Gastrointestinal Surgery,2Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Wannan Medical College(Yijishan Hospital),Wuhu 241001,China摘要：目的 分析TMEM64在肝癌中的表达情况及对肝癌患者预后评估价值，探讨TMEM64对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 采用癌症基因组图谱（TCGA）数据库和基因型组织表达项目（GTEx）分析 TMEM64 在肝癌中表达水平。采用Wilcoxon秩和检验方法比较分析TMEM64基因在肝癌和癌旁组织中的表达差异。利用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析评估TMEM64 的表达水平对肝癌患者总生存期的影响及预后预测价值。通过单样本基因富集分析评估TMEM64的表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性。依据TMEM64 表达水平及相关临床变量构建基于总体生存率的nomogram图并进行验证。细胞实验中，在HCCLM3细胞中敲低TMEM64，分为si-NC（对照组）、si-TMEM64#1（敲低组1）、si-TMEM64#2（敲低组2）3个组；在Huh7细胞中过表达TMEM64，并分为vector（对照组）和TMEM64（过表达组），采用CCK-8、EdU和克隆形成实验检测TMEM64对肝癌细胞增殖的影响，使用Transwell和细胞划痕实验验证TMEM64对肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变。结果 TMEM64在肝癌中的表达水平显著高于癌旁组织（P0.001）。Kaplan-Meier生存分析显示，TMEM64高表达与肝癌患者不良总生存时间相关，差异有统计学意义（P0.05）。多因素Cox回归分析显示，TMEM64高表达是肝癌患者OS的独立危险因素（P0.05）。TMEM64的表达与NK细胞、CD8+T细胞和pDCs细胞的免疫细胞浸润水平呈负相关（P0.05）。GO、KEGG和GSEA富集分析结果显示TMEM64与信号传递及肿瘤转移相关通路显著富集。列线图和校准曲线显示模型预测效能与实际结果相符。敲低TMEM64能抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭（P0.01），过表达TMEM64能促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭（P0.01）。结论 TMEM64在肝癌中高表达，TMEM64高表达是肝癌患者不良预后的独立危险因素。TMEM64能促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。关键词：TMEM64；肝细胞癌；预后；侵袭Abstract:Objective To analyze the expression of TMEM64 in hepatocellular carcinoma(HCC)and investigate the effect ofTMEM64 expression level on proliferation and invasion of HCC cells in vitro.Methods We analyzed the expression level ofTMEM64 in HCC and adjacent tissues based on data from TCGA and GTEx databases.The prognostic value of TMEM64 forHCC patients was examined using Kaplan-Meier survival analysis and a Cox regression model,and a nomogram wasconstructed based on TMEM64 expression and clinical characteristics of the patients.Functional enrichment analysis wasperformed to explore the potential signaling pathways,and immune cell infiltration was assessed using single sample gene setenrichment analysis.We also performed cell experiment to observe the changes in proliferation,migration,and invasion inHCCLM3 cells with TMEM64 knockdown and in Huh7 cells with TMEM64 overexpression using CCK-8,EdU,colonyformation,Transwell,and wound healing assays.Results The expression level of TMEM64 was significantly higher in HCCthan in the adjacent tissues(P0.05).Kaplan-Meier analysis suggested that a high expression of TMEM64 was associated withpoor outcomes of the patients(P0.05).Multivariate Cox regression analysis indicated that a high TMEM64 expression was anindependent risk factor for overall survival of HCC patients(P0.05).TMEM64 expression level was negatively correlated withthe levels of immune cell infiltration by NK cells,CD8+T cells,and plasma pDCs cells(P0.05).GO,KEGG,and GSEAenrichment analyses showed that TMEM64 was significantly enriched with tumor invasion and metastasis pathways.Thenomogram and calibration curves indicated a moderate prediction reliability of the model.In the cell experiment,TMEM64knockdown obviously suppressed and TMEM64 overexpression markedly promoted the proliferation,migration,and invasionof HCC cells(P0.01).Conclusion A high TMEM64 expression may serve as an independent risk factor for poor prognosis ofHCC and promotes proliferation,migration,and invasion of HCC cells in vitro.Keywords:TMEM64;hepatocellular carcinoma;prognosis;invasion肝癌是全球范围内发病率第6和死亡率第3的恶性肿瘤，我国更是肝癌的高发地区 1,2。根据2022年我国癌症中心的最新数据，肝癌在恶性肿瘤中的发病率位于第5，死亡率位于第2，5年生存率仅为14.1%3。大多数肝癌患者早期无症状，确诊时已处于中晚期，失去最佳手术机会 4,5。肝癌患者手术后复发率仍然较高，预后极差 6。挖掘新的诊断标志物和预后预测指标对肝癌患者早期发现，制定个体化治疗方案具有重要临床研究价值。收稿日期：2023-02-06基金项目：国家自然科学基金（82172651，82103293）；安徽省教育厅杰出青 年 基 金（2022AH020074）；安 徽 省 教 育 厅 优 秀 青 年 基 金（2022AH030123）；安徽省自然科学基金（2108085MH287）；安徽省重点研究与开发计划（202104j07020019）；安徽省高校优秀青年人才支持计划（gxyq2021257）；芜湖市科技计划（2022jc52）Supported by National Natural Science Foundation of China(82172651,82103293).作者简介：曹丹萍，在读硕士研究生，E-mail:通信作者：左学良，博士，副教授，E-mail:J South Med Univ,2023,43(8):1345-1355doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.08.111345跨膜蛋白（TMEMs）是一类能够多次跨越细胞膜并参与调控细胞间信号交流和传递的蛋白家族，人类的许多疾病的发生和进展都与跨膜蛋白的功能异常有关 7。目前，已发现较多的TMEMs在恶性肿瘤中表达失调 8-10，参与调控肿瘤侵袭转移相关通路 11-13。TMEM64是一个位于8号染色体上的编码基因，属于跨膜蛋白家族的成员。目前对于TMEM64的研究较少，TMEM64在肝癌中的功能未见报道，有待进一步探索。本研究通过分析癌症基因组图谱（TCGA）和基因型组织表达项目（GTEx）数据库中TMEM64在肝癌中的表达情况和预后预测价值，探究TMEM64对肝癌细胞增殖和侵袭的影响，为肝癌治疗提供新的分子靶标。1 材料和方法1.1 数据库分析从TCGA数据库（n=377）和GTEx数据库中收集了肝癌患者的mRNA表达谱和临床数据。3级HTSeqFPKM 格式数据标准化为每百万次读取的转录本（TPM）。使用UCSC Xena3数据库和GTEx数据库中获得TPM格式的RNA测序数据进行分析。使用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验来比较患者生存差异，并将截止值设置为TMEM64的中位表达水平。单变量和多变量Cox回归分析用于评估临床变量对患者结局的影响。单变量Cox回归分析中的预后变量P0.05被纳入多变量Cox分析。R软件包DESeq2用于分析和计算差异表达基因（DEGs），并将调整后的P值设置为1作为DEG的阈值。使用Spearman相关分析评估前10位DEGs表达与TMEM64之间的相关性。使用R包GOplot和R包clusterProfiler 对DEGs进行了功能富集分析，包括GO、KEGG通路富集分析和GSEA基因集富集分析，调整后的P0.05和错误发现率（FDR）0.25被视为统计上显著富集的功能或通路。R软件包rms用于构建nomogram和calibration曲线。通过Cox比例风险回归模型评估肝癌患者总生存时间（OS）的独立危险因素。结合TMEM64 的表达水平与多因素 Cox 回归模型中的临床变量，构建nomogram来预测1年、3年和5年的肝癌患者总生存率，使用cali