不同养殖厂美洲大蠊提取物的化学成分分析及多成分含量测定.pdf

基金项目国家自然科学基金项目（81860742；82060780）；云南省科技计划项目（202001AT070021）；云南省重大科技专项计划项目（202002AA100007）；云南省科技人才和平台计划项目（202105粤郧070012）收稿日期2023-01-13修回日期2023-03-15第一作者简介陆西星，硕士研究生，主要从事中药药理学研究。*通信作者：刘衡，助理研究员，博士，E-mail：。美洲大蠊 Periplaneta americana L.属昆虫纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，又称蟑螂或蜚蠊1，最早记载于 神农本草经，味咸、性寒，被列为中品，“主血瘀，症坚，寒热，破积聚，喉咽痹，内寒无子”，具有活血散瘀、解毒消疳等功效2。中药化学及药理学研究3-9发现，美洲大蠊提取物主要成分有蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、黄酮、香豆素等，具有调节免疫、促进组织修复、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等作用，尤其在消化性溃疡动物模型中，其抗炎及促黏膜愈合作用显著。目前美洲大蠊药材质量控制主要是总氨基酸和核苷类成分10，但它们在提取物中占比不高，是否为药效物质仍不明确，且不同工艺对各成分含量结果影响很大，因此难以全面有效地评价美洲大蠊提取物的质量。本课题组前期制备了对结直肠炎有显著疗效的美洲大蠊提取物 PA（以下简称“PA”）11，为进一步探究 PA 的药效物质，探讨不同养殖厂美洲大蠊药材质量的均一性，本研究制备了 20 批 PA，并进行化学成分分析和多成分含量测定，进一步为美洲大蠊提取物的物质组成及质量评价提供一定科学依据。1材料与仪器1.1药材来源及鉴定20 批美洲大蠊干燥虫体由大理大学药学院杨永寿高级实验师提供，经大理大学昆虫生物医药研究院杨自忠教授鉴定为昆虫纲蜚蠊科大蠊属美洲大蠊。1.2试剂牛血清白蛋白（BSA）对照品、福林酚试剂（北京索莱宝科技有限公司，批号：YB0006-50、C11335288）；葡萄糖、芦丁、茚三酮（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20090526、FY22B712、FY24020S209）；碘化钾试液（广东光华科技股份有限公司，批号：20121206）；原花青素（上海市源叶生不同养殖厂美洲大蠊提取物的化学成分分析及多成分含量测定陆西星1，2，朱玲3，吴浩3，张成桂1，杨永寿1，陈志鹏3，刘衡1，3*（1.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000；2.云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用研究重点实验室，昆明650000；3.南京中医药大学药学院，南京210023）摘要目的：探究美洲大蠊提取物 PA 的化学成分类型及含量。方法：采用显色鉴别法鉴定美洲大蠊提取物 PA 中的成分类型；采用紫外分光光度法测定美洲大蠊提取物 PA 中多肽、氨基酸、多糖、生物碱及酚类的含量，HPLC 测定美洲大蠊提取物 PA 中尿嘧啶、肌苷、原儿茶酸的含量。结果：所建立各成分含量测定的方法具有良好的重复性和稳定性，20 批次美洲大蠊提取物 PA主要成分为多肽、氨基酸、多糖、生物碱和酚类，以及尿嘧啶、肌苷和原儿茶酸等成分，不同批次的美洲大蠊提取物 PA 主成分差异不明显。因采收时间和养殖条件的不同，不同厂家不同批次美洲大蠊提取物 PA 的成分含量存在一定差异。结论：通过分析美洲大蠊提取物 PA 的化学成分及含量，为后续药效物质的筛选及全面有效评价美洲大蠊药材的质量提供依据。关键词美洲大蠊提取物；显色鉴别；紫外分光光度法；HPLC中图分类号R284.1文献标志码A文章编号2096-2266（2023）08-0030-09DOI10.3969/j.issn.2096-2266.2023.08.007大理大学学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY第8卷第8期2023年8月Vol.8No.8Aug.2023物科技有限公司，批号：H27J9Z64554）；溴甲酚绿（上海润捷化学试剂公司，批号：20160721）；FeCl3（成都市科龙化工试剂厂，批号：20130928）；AlCl3（国家标准物质资源平台，批号：C10925190）；丙氨酸、丹皮酚、小檗碱、胆酸、尿嘧啶、肌苷、原儿茶酸（中国食品药品检定研究院，批号：140680-201604、110708-201407、C12750870、20140805、100469-201302、140669-201606、110809-201906）。1.3仪器SpectraMax M2 型多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；先行者 CP214 型电子天平（奥豪斯仪器有限公司，千分位）；T6 新世纪紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；TLC16M 型高速冷冻离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；FreeZone 4.5 冷冻干燥机（美国 Labconco公司）；旋转蒸发仪（瑞士 Buchi 公司）；2010A 高效液相色谱仪（日本SHIMADZU 公司）。2方法与结果2.1PA 的制备称取美洲大蠊干燥全虫 15 g 置于 500 mL 圆底烧瓶，按 1颐10 的料液比添加超纯水，90 益提取 3 次，每次 2 h，合并提取液，过滤，旋转蒸发仪浓缩至约 1.0 g/mL 流浸膏后加入无水乙醇，使含醇量达到 60%，静置 24 h 后离心取上清液，回收乙醇至上清液无醇味，冷冻干燥，即得 PA。按此方法制备 20 批 PA，回收率为 9.20%10.21%。2.2供试品溶液的制备随机称取 1 批 PA 冻干样品 1.0 g，置于 25 mL 离心管中，加入 10 mL 水，溶解，过滤，取供试液用于检测多肽、氨基酸、多糖、鞣质、有机酸、酚类等化学成分；另称 1 份 PA 冻干样品 1.0 g，置于 25 mL 离心管中，加入 10 mL 5%盐酸，溶解，过滤，取供试液用于检测生物碱类化学成分；另称 1 份 PA 冻干样品 1.0 g，置于 25 mL 离心管中，加入 10 mL 无水乙醇，超声溶解 15 min，过滤，取供试液用于检测香豆素、黄酮、甾体等化学成分。2.3PA 化学成分鉴别采用显色鉴别法对 PA 化学成分进行鉴别分析，结果显示 PA 主要含有有机酸、多肽、氨基酸、多糖、生物碱和酚类等成分。见表1。2.4对照品溶液的制备精密称取 BSA 对照品 15mg，置于 100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得 150 滋g/mL 的 BSA 对照品溶液；精密称取丙氨酸对照品 5 mg，置于 50 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得 100 滋g/mL 丙氨酸对照品溶液；精密称取葡萄糖对照品 5 mg，置于 100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得 50 滋g/mL 葡萄糖对照品溶液；精密称取小檗碱对照品 8 mg，置于 100 mL容量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，即得 80 滋g/mL小檗碱对照品溶液；精密称取原儿茶酸对照品检测项目试剂或反应名称现象结果有机酸精密 pH 试纸试纸变成橙红色，pH=6.57.0+多肽双缩脲反应浅棕色变为浅蓝色+氨基酸茚三酮试剂浅棕色变为深紫色+多糖斐林试剂浅棕色变为砖红色，产生沉淀+酚类1%FeCl3试剂浅棕色变为深棕色+鞣质氯化钠明胶试验无明显变化-生物碱碘化钾试剂无沉淀，颜色无明显变化-改良碘化铋钾试剂无沉淀，颜色无明显变化-溴甲酚绿-氯仿反应氯仿萃取液颜色变黄+黄酮1%AlCl3试剂颜色无明显变化，无荧光-香豆素荧光试验无荧光-甾体氯仿-浓硫酸反应氯仿层红色，浓硫酸层绿色荧光-表 1PA 化学成分类别的鉴别结果扇墒设设设设设缮设设设设设注：“+”表示检测到该成分，“-”表示未检测到该成分。陆西星，朱玲，吴浩，等不同养殖厂美洲大蠊提取物的化学成分分析及多成分含量测定总第 92 期第 8 卷5 mg，置于 5 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得 1 mg/mL 原儿茶酸对照品溶液。2.5线性关系考察2.5.1多肽标准曲线的绘制精密量取“2.4”项下BSA 对照品溶液 0、2、8、12、16、20 滋L 加到 96 孔板中，加标准品稀释液补足至 20 滋L，对照品浓度分别为 0、15、60、90、120、150 滋g/mL，各孔加入 200 滋LBCA 工作液，37 益放置 2030 min，于 545 nm 波长处测定吸光度值12。以质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制多肽标准曲线，得回归方程：Y=0.144 9X+0.214 9，r2=0.999 3，线性范围：0.013.6 滋g/mL。2.5.2氨基酸标准曲线的绘制精密量取“2.4”项下 丙 氨 酸 对 照 品 溶 液 0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mL，置于 5 支 10 mL 试管中，加水至 1.0 mL，分别加入 pH 6.0 醋酸钠缓冲液 2.0 mL 和 2.0%茚三酮溶液 1.5 mL，混匀，在 95 益水浴反应 15 min 后，放至室温，取 200 滋L 加到 96 孔板中，于 545 nm 波长处测定吸光度值13。以质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制氨基酸标准曲线，得回归方程：Y=0.06X+0.025 4，r2=0.999 7，线性范围：4.413.3 滋g/mL。2.5.3多糖标准曲线的绘制精密量取“2.4”项下葡萄糖对照品溶液 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，置于 10 mL 试管中，加水至 2.0 mL，加入 5%苯酚溶液 1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸 5.0 mL，继续摇匀，放至室温后，取 200 滋L 加到 96 孔板中，于 490nm 波长处测定吸光度值14。以质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制多糖标准曲线，得回归方程：Y=0.001 1X+0.116 4，r2=0.993 2，线性范围：1.256.25 滋g/mL。2.5.4生物碱标准曲线的绘制精密量取“2.4”项下 小 檗 碱 对 照 品 溶 液 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL，置于 5 支 10 mL 试管中，加水至 8.0 mL，加入0.04%溴甲酚绿缓冲溶液 2.0 mL，剧烈振摇 3 min，静置 30 min 取下层氯仿液，定容至 10 mL，取 200滋L 加到 96 孔板中，于 416 nm 波长处测定吸光度值15。以质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制生物碱标准曲线，得回归方程：Y=0.023 5X+0.033 1，r2=0.998 3，线性范围：0.4耀2.0 滋g/mL。2.5.5酚类标准曲线的绘制 精密量取“2.4”项下原 儿 茶 酸 对 照 品 溶 液 0.01、0.05、0.10、0.15、0.20mL，置于 5 支棕色 10 mL 试管中，加水至 1.0 mL，加入 2.0 mL 去离子水和 2.0 mL 福林酚试剂，静置 5 min后加入 2.4 mL 10%Na2CO3溶液，用去离子水定容至 10 mL，混匀后室温静置 70 min，取 200 滋L 加到96 孔板中，于 760 nm 波长处测定吸光度值16。以质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制酚类标准曲线，得回归方程：Y=0.014 8X+0.064 8，r2=0.998 3，线性范围：120 滋g/mL。2.6方法学验证2.6.1精密度试验随机称取 1 批 PA 冻干粉 10mg 于容量瓶中，加水溶解，定容至 10 mL，滤过，取续 滤 液 1.0 mL 分 别 至 6 支 10 mL 试 管 中，按“2.5.1”项下条件检测；随机称取 1 批 PA 冻干粉 20mg，加水溶解，定容于 10 mL 容量瓶，滤过，取续滤液 0.1 mL 分别至 6 支 10 mL 试管中，按“2.5.2”项下条件检测；随机称取 1 批 PA 冻干粉 20 mg，加水溶解，定容于 10 mL 容量瓶，滤过，取续滤液 0.1 mL分别至 6 支 10 mL 试管中，按“2.5.3”项下条件检测；随机称