P75NTR裂解抑制剂对CPZ诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用.pdf

6期在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中，髓鞘不仅在神经冲动的传导中发挥重要作用，在维持正常行为方面也至关重要1。因此，当髓鞘受损后，神经冲动的传导会被延迟甚至阻滞，行为方面也会有异常表现。研究2显示，脱髓鞘疾病（如多发性硬化、精神分裂症等）的各个脑区均存在不同程度的髓鞘脱失，其中海马髓鞘的脱失与记忆、学习及认知功能最为相关。并且，髓鞘损伤后，促进髓鞘的形成可以在一定程度上改善认知功能3。因此，探究髓鞘损伤后促进海马髓鞘形成的途径，具有重要的理论意义和实际应用价值。在 CNS 中，神经营养素在中枢正常功能的维持与损伤后的修复中都具有重要作用4。神经营养素通过 P75 神经营养素受体（neurotrophin re原ceptor P75，P75NTR）而介导下游通路，发挥生物学效应5。根据细胞内环境的不同，P75NTR 在结合神经营养素后既可以通过核因子-资B 途径提高细胞存活率，也可以在 琢 和 酌-分泌酶的顺序性切割（也称 P75 裂解）作用下诱导细胞凋亡6。进一步的研究7-9表明，脊髓、脑损伤后，阻断P75NTR 裂解，可以减少神经元、少突胶质细胞的凋亡，轴突可塑性及认知功能障碍也可以得到改善。最新研究10显示，P75NTR 参与神经保护及再生。本研究选用双环己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）构建脱髓鞘模型，通过观察抑制 P75 裂解对小鼠行为学及海马组织中髓鞘的影响，以明确P75NTR 在脱髓鞘模型小鼠认知功能及海马中髓鞘形成的作用。1材料与方法1.1实验动物56 周龄健康雄性 C57BL/6 小鼠 40 只，体质量（21依2）g，购自宁夏医科大学实验动物中心合格证编号：SCXK（宁）2020-0001，本研究经宁夏医科大学实验动物中心实验动物福利伦理委员会审核（批准号：2014-014）。所有小鼠饲养于 SPF 级动物房 温度（24.0依1.0）益，湿度 55%收稿日期：2022-11-23基金项目：国家自然科学基金项目（82060238）；宁夏自然科学基金项目（2022AAC03154）作者简介：陈飞飞（1989），男，在读硕士研究生，研究方向：神经损伤与修复。E-mail：通信作者：刘娟（1970），女，教授，研究方向：精神疾病与海马神经发生。E-mail：P75NTR 裂解抑制剂对 CPZ 诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用陈飞飞1，2，米晓娟1，丰子琦1，李君洁3，杨治伦1，刘娟1，4（1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川750004；2.汾阳市人民医院，汾阳032200；3.宁夏医科大学口腔医学院，银川750004；4.宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室，银川750004）摘要：目的探究 P75 神经营养素受体（neurotrophin receptor P75，P75NTR）裂解抑制剂对双环己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用。方法采用连续喂食 0.2%CPZ 的方法构建急性脱髓鞘模型（CPZ 小鼠），同时设立对照组；5 周后，在 CPZ 小鼠海马区注射 P75NTR 裂解抑制剂或生理盐水。在第 6 周，通过水迷宫、高架十字迷宫实验检测小鼠行为学的改变；通过快蓝染色检测髓鞘脱失情况；通过 Western blot 检测海马组织中 P75NTR 及髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）的表达变化；通过免疫组织化学检测海马组织中 MBP 阳性表达量的变化。结果与对照组相比，CPZ 小鼠逃避潜伏期增加，跨台次数、进入开臂及在开臂中活动时间减少（P均约0.05）；快蓝染色结果显示，CPZ 小鼠胼胝体区髓鞘结构疏松，着色明显变浅；CPZ 小鼠海马区 P75NTR 表达增加（P约0.05）；CPZ 小鼠海马区 MBP 表达减少（P约0.05）。相比于生理盐水的干预，P75NTR 裂解抑制剂干预后，小鼠逃避潜伏期降低，进入开臂及在开臂中活动时间增加（P均约0.05）；P75NTR 裂解抑制剂干预后，小鼠海马区 MBP 表达上升（P约0.05）。结论抑制 P75NTR 的裂解可以改善 CPZ 模型小鼠的认知功能障碍，其作用机制与减轻海马中髓鞘脱失有关。关键词：脱髓鞘；P75 神经营养素受体；酌-分泌酶抑制剂；海马；双环己酮草酰二腙中图分类号：R322.8文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.002第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University文章编号：1674-6309（2023）06-547-06论著547窑窑宁夏医科大学学报4缘卷耀65%，12 h 昼夜循环，每笼 5 只，小鼠饮食、饮水自由。1.2主要试剂及仪器CPZ（C9012）购自美国 Sigma 公司，兔抗MBP多克隆抗体（ab218011）购自美国 Abcam 公司，鼠抗 茁-actin 单克隆抗体（TA-09）、兔抗 GAPDH 单克隆抗体（TA-08）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗 P75NTR 购自成都正能生物技术有限责任公司（381005）。全蛋白提取试剂盒（KGP250）、BCA 蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA）均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，化学发光检测试剂盒（SQ202）购自上海雅酶生物医药科技有限公司。奥林巴斯 BX51 正置显微镜购自日本 Olympus 公司。AI600 成像系统购自美国通用电气公司，DB001 Morris 水迷宫实验装置购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，荧光显微镜购自德国 LEICA 公司。1.3脱髓鞘模型的制备和动物分组将 40 只小鼠随机分为正常（Control）组、模型（CPZ）组、酌-分泌酶抑制剂 DAPT 处理（CPZ-DAPT）组和生理盐水处理（CPZ-NS）组，每组 10只。Control 组小鼠正常饲养，其他组别喂食含0.2%CPZ 的饲料，5 周后分别在 CPZ-DAPT 组和 CPZ-NS 组小鼠海马区注射 DAPT 和生理盐水，注射完成后继续同前饲养 1 周。第 6 周进行后续实验。实验流程均严格按照 关于善待实验动物的指导性意见 的相关规定执行。1.4方法1.4.1Morris 水迷宫实验选用经典的 Morris水迷宫系统，泳池内注入适量自来水（淹没平台约 1 cm）后加入无毒、环保的白色色素染色剂，使水变成白色不透明状，水温恒定（24.0依1.0）益，实验过程中保持安静的周围环境。实验分为定位巡航和空间探索两部分11。1.4.2高架十字迷宫实验所采用的高架十字迷宫包括开放臂和封闭臂各 圆 个，四臂互相交汇形成十字状。实验过程中保持周围环境的安静，且每只小鼠在进行该实验前均用 75%乙醇擦拭各臂，以消除前只小鼠残留的气味12。1.4.3立体定位注射称重小鼠，吸入 3.5%异氟醚 N2O颐O2（70颐30）的混合物，待小鼠无深度反射后进行手术。实验中 DAPT 的剂量为 0.03 mg kg-1，注射泵推进速度为 0.05 滋L min-1，注射结束后继续等待 5 min 以保证药物弥散。将术后小鼠放置于电热毯中直至恢复清醒，然后继续饲养13。1.4.4快蓝染色检测模型组小鼠髓鞘脱失将小鼠完整的脑组织经固定、脱水及石蜡包埋后切片。将组织切片用二甲苯脱蜡后浸于 95%乙醇4耀6 min，再将切片浸入配制好的快蓝染液中 56 益过夜；次日取出复温后用蒸馏水冲洗，依次浸入碳酸锂和 75%乙醇中分化；再经梯度乙醇、二甲苯脱水，透明后封片，于镜下观察脑组织脱髓鞘情况。1.4.5Western blot 检测 MBP 和 P75NTR 蛋白的表达行为学实验结束后麻醉、脱颈处死小鼠，于冰上快速取出海马组织，提取小鼠海马总蛋白后 BCA 法测定蛋白浓度。将蛋白按照提前计算好的上样量加到各泳道，进行电泳。转膜：裁剪适当大小的 PVDF 膜，在 4 益冰箱中按照 1耀1.5 kDa min-1进行恒流/恒压转膜。封闭及孵育抗体：转膜完成，将 PVDF 膜置于 5%脱脂牛奶中室温封闭 1 h 后孵育一抗（1颐1 000），4 益过夜；次日，漂洗后室温下孵育二抗（1颐5 000）1 h，再次漂洗后曝光。曝光：ECL 显色并记录，Image J 软件分析目的蛋白条带结果，最后经均一化处理后进行统计分析。1.4.6免疫组织化学检测海马组织中 MBP 阳性细胞数量的变化将小鼠完整的脑组织经固定、脱水及石蜡包埋后切片。切片分别于二甲苯、梯度乙醇中脱蜡，置于柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复 10 min，自然降至室温后滴加内源性过氧化物酶阻断剂到海巴组织上，室温孵育 20 min，加一抗（1颐200）4 益过夜，次日复温 1 h 后滴加酶标羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物，室温孵育 1 h，滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显色满意后用苏木素复染，1%盐酸乙醇分化并脱水，透明后用中性树脂封片。用奥林巴斯 BX51 正置显微镜拍摄采片后，Image J 软件统计小鼠海马区的阳性细胞。1.5统计学方法采用 SPSS 23.0 软件及 GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析，经正态性检验呈正态分布的计量资料以均数依标准差（x依s）表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析；非正态分布的计量资料采用中位数（第25 百分位数，第 75 百分位数）M（P25，P75）描述，组间比较采用非参数检验。P臆0.05 为差异有统计学意义。548窑窑6期2结果2.1CPZ 诱导小鼠出现认知功能减退2.1.1Morris 水迷宫相比于 Control 组，CPZ 组小鼠逃避潜伏期 （19.43依1.79）s vs.（29.55依3.47）s延长，跨越平台次数 （1.50依0.97）次 vs.（0.70依0.67）次 减少（P 均约0.05），提示 CPZ 组小鼠学习记忆能力和空间认知能力下降，见图 1A。2.1.2高架十字水迷宫与 Control 组相比，CPZ组小鼠进入开臂的次数 （20.90依8.77）次 vs.（10.10依4.68）次 及在开臂中滞留的时间 （106.00依35.91）s vs.（49.78依34.93）s 减少（P 均约0.05），提示CPZ组小鼠出现焦虑样症状，见图 1B。2.2CPZ 对小鼠胼胝体髓鞘完整性的作用快蓝染色可显示髓鞘的完整性，结果如图 2所示：Control 组小鼠大脑胼胝体区着色明显，CPZ 组着色减少，提示 CPZ 诱导后小鼠脑内出现明显的髓鞘脱失。悦ontrol 组悦PZ 组50 滋m50 滋m图 2快蓝染色检测 CPZ 对小鼠胼胝体髓鞘的影响2.3CPZ 对小鼠海马组织中 P75NTR 蛋白表达的作用与 Control 组相比，CPZ 组小鼠海马组织中P75NTR 的表达升高（P约0.0员），提示 CPZ 诱导P75NTR 高表达，P75NTR 可能参与脱髓鞘过程，见图 3。2.4CPZ 对小鼠海马组织中 MBP 表达的作用与对照组相比，CPZ 喂养可降低 MBP 的表达（P约0.05），提示 CPZ 诱导小鼠海马组织中髓鞘脱失，见图 4。2.5DAPT 可改善 CPZ 诱导的小鼠认知功能减退2.5.1Morris 水迷宫实验相比于生理盐水干预，DAPT 干预的小鼠逃避潜伏时长 （28.95依1.73）s vs.（24.50依1.29）s 缩短（P约0.05），而跨越平台次数 （0.70依0.63）次 vs.（1.20依0.67）次 差异无统计学意义（P跃0.05），见图 5粤。2.5.2高架十字水迷宫实验相比于生理盐水干 预，DAPT 干预 的小鼠进入 开放臂 的 次数（8.50依3.13）次 vs.（12.20依3.34）次 及在开放臂中滞留的时间 （68.28依33.73）s vs.（93.41依13.35）A.Morris 水迷宫实验；B.高架十字水迷宫实验