不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用.pdf

Journal of Lanzhou University(Natural Sciences),2023,59(3)/June兰州大学学报（自然科学版），2 0 2 3，59(3）6 月不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用王娟娟，达晓伟，王馨，庞海龙2，贾凌云2，冯汉青1.21.西北师范大学生命科学学院，兰州7 30 0 7 02.西北师范大学新农村发展研究院，兰州7 30 0 7 0摘要：以BY-2烟草悬浮细胞为实验材料，探究在不同磷酸盐供应水平下细胞内ATP(iATP)、细胞外ATP(eATP)水平的变化以及NO在其中的调节作用.结果表明，随着磷酸盐供应水平的增加,iATP水平呈现上升趋势；伴随着iATP的上升，eATP也呈现相似的变化.与ATP的变化不同，随着磷酸盐供应水平的增加NO水平呈现下降趋势.在正常水平磷酸盐供应下，NO供应剂可增加iATP和eATP水平；NO合成抑制剂降低了iATP和eATP水平.在较低和较高水平的磷酸盐供应下，NO供应剂和合成抑制剂对于iATP和eATP水平的影响呈现与正常水平磷酸盐供应下不同的调节效应，表明磷酸盐供应水平能够影响iATP和eATP的水平；NO对细胞ATP水平具有调节作用，其调节效应与环境磷酸盐供应水平有关.关键词：磷酸盐；一氧化氮；胞外ATP；胞内ATP中图分类号：Q942文献标识码：A文章编号：0 4 55-2 0 59(2 0 2 3)0 3-0 34 6-0 5D0I:10.13885/j.issn.0455-2059.2023.03.008Changes in intracellular and extracellular ATP levels in plant cells underdifferent phosphate supply levels and regulation of nitric oxideWANG Juan-juan,DA Xiao-wei,WANG Xin,PANG Hai-long*,JIA Ling-yun2,FENG Han-qing.-21.College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China2.New Rural Development Research Institute,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,ChinaAbstract:BY-2 tobacco suspension cells were used as experimental materials to investigate the changesin the intracellular ATP(iATP)and extracellular ATP(eATP)levels under different levels of phosphatesupply and the regulatory role of nitric oxide in this process.The results showed that the level of iATP in-creased with the increasing level of phosphate supply,which was followed by an increase of eATP leveland decrease of the content of NO.Under a normal level of phosphate supply,the application of NO do-nor increased the levels of iATP and eATP,while the inhibitor of NO synthesis reduced that of iATP andeATP.Under the condition of either a lower or high level of phosphate supply,the effects of NO donorand inhibitor of NO synthesis on the iATP and eATP levels were different from those under a normal lev-el of phosphate supply.These studies suggested that differences in the levels of phosphate supply could收稿日期：2 0 2 2-0 3-2 8修回日期：2 0 2 2-0 5-11基金项目：国家自然科学基金项目(318 7 0 2 4 6);甘肃省重点研发计划项目(2 2 YF7NA119);甘肃省科技重大专项(2 2 ZD1NA001);甘肃省引导科技创新发展专项(2 0 19 ZX-05)；西北师范大学新农村发展研究院开放基金作者简介：冯汉青(19 7 8-)，男，河北保定人，教授，博士研究生导师，e-mail:，研究方向为植物生理学，通信联系人：347王娟娟，等：不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用affect the levels of iATP and eATP in plant cells.NO could play a role in regulating the changes in iATPand eATP levels,but the regulatory effect of NO in this process was related to the level of phosphatesupply.Key words:phosphate;nitric oxide;extracellular ATP;intracellular ATP磷是核酸、磷脂类等物质的构成基础，对植物的生长和发育具有重要作用 在自然环境中，磷主要以磷酸盐的形式存在 2 .对植物磷酸盐供应量的变化会引起植物体内核酸、蛋白质等物质合成量发生变化，同时植物的呼吸、光合作用等初级代谢也会由于磷酸盐供应量发生改变 3；植物一些次级代谢物如花色苷、苯丙素等物质的合成也受到磷酸盐供应量的影响三磷酸腺苷(adenosine-5-triphosphate,ATP)主要在细胞内合成.传统观念认为，ATP是生物体内的“能量货币”分子，驱动细胞内的能量依赖性反应 5.研究发现，动物、植物以及微生物细胞均可以将细胞内ATP(intracellular ATP,iATP)通过多种方式释放到细胞外基质中，使得细胞外也存在一定水平的ATP,即细胞外ATP(extracellularATP,eATP)和iATP不同，eATP是一种重要的信号分子.动物细胞中，eATP可以结合其质膜上的跨膜受体蛋白调节细胞生长及免疫等生理过程 8 ；植物细胞中，eATP对于植物细胞的活力、生长发育、抵抗逆境等均具有重要的调控作用一氧化氮是生物体内重要的信号分子 10 ,，在植物和动物的生长发育和代谢中起到重要的调节作用 在植物对磷酸盐供应变化的响应过程中，NO起到重要的调节作用.多种植物在磷元素缺乏的环境中NO水平会显著升高 12 .WANG等 13 发现，在磷供应不足时，白羽扇豆根在主根和侧根中NO积累量增多，NO的积累会促进簇状根的形成和柠檬酸盐渗出的增加，提升根对磷酸盐的吸收.玉米在磷元素缺乏下，NO能够增加酸性磷酸酶的活性并提高植物对磷酸盐的吸收能力14 .水稻在磷元素缺乏下细胞壁中磷的再分配受到NO的调控5,尽管磷是ATP构成的重要元素，但磷酸盐供应水平变化对植物ATP,尤其是植物eATP水平的影响鲜见报道.在磷酸盐供应水平变化下，NO是否具有调节iATP和eATP水平的作用也不得而知.本研究以烟草(Nicotianatabacum)悬浮细胞为材料，研究不同磷酸盐供应水平下iATP和eATP的变化,以及NO在其中的调控作用.1材料与方法1.1实验材料以烟草悬浮细胞(N.tabacum cv.BY-2)为材料，将细胞接种于添加了质量浓度3%蔗糖和0.2mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的MS(Murashige-Skoog)液体培养基中，在2 7、130 r/min黑暗条件下振荡培养.每隔1个生长周期(7 d),吸取10mL细胞培养物，加人到2 0 0 mL的新鲜MS液体培养基中完成传代培养.使用生长对数期(接种后第4 天)的烟草悬浮细胞为材料，以上步骤均在无菌条件下完成.1.2烟草悬浮细胞的处理配制标准MS培养基(其中磷酸二氢钾浓度为1.25mmol/L),设定其为1P培养基；并依此配制OP培养基(不含磷酸二氢钾的MS培养基)、0.2 5P培养基(磷酸二氢钾浓度为1P的0.2 5倍)、2 P培养基(磷酸二氢钾浓度为1P的2 倍).称2 g培养到第4 天的烟草悬浮细胞置于不同磷浓度的MS培养基中培养36 h,用于指标测定。选择OP、0.2 5P、1P、2 P的MS培养基培养的细胞,用0.1mmol/L的硝普纳(SNP,NO的供体)或0.15mmol/L的NO的合成抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)处理上述细胞,培养36 h后,用于指标测定，1.3iATP的测定吸取1mL细胞于离心管中，于4、50 0 0 r/min离心5min，吸取上清液于另一离心管中备用.将样品液与ATP检测液（含荧光素酶和荧光素，碧云天ATP检测试剂盒)按照1:1体积比进行混合16;使用化学发光仪检测化学发光强度，根据ATP标准曲线进行换算，1.4eATP的测定吸取1mL细胞于离心管中，于4、50 0 0 r/min离心5min，弃上清液，用ATP检测裂解液(碧云天ATP检测试剂盒)裂解细胞，加人2 0 0 L裂解液静置2 min后，在4、50 0 0 r/min离心5min，取上清液.在上清液(样品液)中按照1：1体积比加人348兰州大学学报(自然科学版)，2 0 2 3，59(3)ATP检测液，使用化学发光仪检测化学发光强度，根据ATP标准曲线进行换算.1.5NO含量的测定使用NO荧光探针DAF-FMDA(3-amino,4-aminoomethyl-2,7-difluorescein diacetate）检测NO含量17 .取1mL细胞于离心管中，4 0 0 0 r/min离心2 min，取一定体积的上清液加人5mol/L的DAF-FMDA.在2 5黑暗条件下孵育2 0 min.加人800L磷酸缓冲液，4 0 0 0 r/min离心2 min，弃上清液以除去未进人细胞的染料.在沉淀中加人10 0 L磷酸缓冲液，吹打混匀.采用徕卡激光共聚焦显微镜在4 9 5nm激发波长、515nm发射波长下检测荧光并成像.利用图像分析软件ImageJ(1.8.0)对细胞中单位面积NO荧光强度进行定量分析.1.6统计分析实验结果和NO量化图所得结果为至少3次独立实验的平均值，实验结果均用平均值土标准差表示，采用双总体t检验数据，在P0.05水平上差异显著。2结果与分析2.1iATP水平的变化随着磷酸盐供给水平的增加，iATP水平总体上呈现增加的趋势，在0 1P时，iATP水平明显上升.当磷酸盐浓度为2 P时，iATP水平与1P保持一致，无显著变化(表1).表1不同浓度磷酸二氢钾对烟草悬浮细胞iATP、e A T P水平及NO荧光强度的影响Table 1Effects of different concentrations of potassium dihydrogen phosphate oniATP,eATP levels and NO fluorescence of tobacco suspension cells磷酸二氢钾浓度iATP/(mol/L)eATP/