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第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.4Aug.2023SMF2和T39代谢产物对国槐根茎腐烂病致病镰刀菌的抑菌活性赵晓彤，王桂清*（聊城大学农学与农业工程学院，山东 聊城 252000）摘要：【目的】研究长枝木霉SMF2和哈茨木霉T39的不同培养液和培养时间的代谢产物和不同有机溶剂的萃取物对镰刀菌的抑菌活性，明确SMF2和T39抑菌活性物质的培养条件和提取方法。【方法】以引起国槐根茎腐烂病的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（F.solani）、多隔镰刀菌（F.decemcellulare）、木贼镰刀菌（F.equiseti）和F.keratoplasticum为靶标，采用菌丝生长速率法测定抑制率及毒力。【结果】SMF2和T39的PD培养液对尖孢镰刀菌的抑制作用最强；以WBM为营养基质、培养5 d的SMF2培养液，以PD营养基质、培养7 d的T39培养液，抑菌效果最优；正丁醇为SMF2和T39的抑菌活性物质的最佳提取溶剂，分步提取法正丁醇提取物对尖孢镰刀菌的抑菌效果良好，EC50仅为187.39和193.60 mg/L。【结论】SMF2和T39对镰刀菌具有较强的抑制效果；优化了木霉抑菌活性物质的营养条件和培养时间。关键词：长枝木霉SMF2；哈茨木霉T39；镰刀菌；培养液；抑菌活性中图分类号：S476.1 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）04-0658-07Bacteriostatic Activity of Metabolites SMF2 and T39 against Pathogenic Fusarium of Root Rot Disease on Sophora japonicaZHAO Xiaotong，WANG Guiqing*（Agricultural Science and Engineering School，Liaocheng University，Liaocheng 252000，Shandong，China）Abstract:【Objective】This paper was conducted to study the antibacterial activities of metabolites of different culture media and incubation times of Trichoderma longibrachiatum SMF2 and T.harzianum T39 and extracts of different organic solvents on Fusarium，and to clarify the culture conditions and extraction methods of SMF2 and T39 bacteriostatic active substances.【Method】Fusarium oxysporum，F.Solani，F.decemcellulare，F.equiseti and F.Keratomoplasticum，which caused root rot disease on Sophora japonica Linn were used as the test target，and the inhibition rate and virulence were determined by mycelial growth rate method.【Result】The results showed that the PD culture medium of SMF2 and T39 had the strongest inhibitory effect against F.oxysporum.SMF2 culture medium with WBM as nutrient matrix cultured for 5 days，and T39 culture medium with PD nutrient matrix cultured for 7 days had the best bacteriostatic effect.N-butanol was the best extraction solvent of the bacteriostatic active substances of SMF2 and T39，and the step-by-step extraction N-butanol extract has a good antibacterial effect against F.oxysporum，and the EC50 was only 187.39 and 193.60 mg/L.【Conclusion】SMF2 and T39 have strong inhibitory effects on Fusarium.The nutritional conditions and incubation time of Trichoderma bacteriostatic active were optimized.Keywords:Trichoderma longibrachiatum SMF2；T.harzianum T39；Fusarium；culture medium；bacteriostatic activitydoi：10.16036/j.issn.1000-2650.202305239收稿日期：2023-01-09基金项目：国家自然科学基金项目（32001929）；山东省自然科学基金项目（ZR2020MC125）。作者简介：赵晓彤，硕士研究生，E-mail：。*责任作者：王桂清，博士，教授，主要从事植物保护教学与科研，E-mail：。第 4 期赵晓彤，等：SMF2和T39代谢产物对国槐根茎腐烂病致病镰刀菌的抑菌活性木霉（Trichoderma）因具有广泛适应性、产生拮抗物质的多样性和寄生的广谱性而被认为是最有希望的生防因子1，木霉属真菌的某些种和菌株对镰刀菌具有较强的抗生活性因而可用作生物防治的有益微生物2，哈茨木霉（T.harzianum）和长枝木霉（T.longibrachiatum）是最为常见的木霉菌3-4。木霉菌的生防机制多样，最重要的为抗生作用5-6，能够产生180种以上的抗生性次级代谢产物，例如木霉毒素、胶霉毒素和康宁霉素7等，从而对植物病原物具有拮抗作用8。镰刀菌（Fusarium）为真菌中较大的一个类群，现已报道的种类超500种，多为植物致病菌，引起番茄、大豆、西瓜、大蒜和国槐等植物病害有些镰刀菌还可以产生真菌毒素，严重危害人畜健康9-11。王桂清等12研究表明尖孢镰刀菌（F.oxysporum）等5种镰刀菌为国槐根茎腐烂病的致病菌，该病主要危害国槐枝干，造成皮层纵向开裂、溃烂，进而树势衰弱，最后导致枝干或整株死亡。哈茨木霉是目前农业生物防治中最具商业化价值的木霉菌，应用广泛；长枝木霉是较为常见的拮抗类木霉，在植病生防中越来越受到重视。本研究以长枝木霉SMF2和哈茨木霉T39为研究对象，以引起国槐根茎腐烂病的5种镰刀菌为靶标菌，通过比较SMF2和T39不同培养液、不同培养时间、不同有机溶剂和不同提取方法得到的代谢产物对镰刀菌的抑菌活性，明确SMF2和T39次生代谢产物的最佳培养条件及对病原菌的抑菌效果，为日后深入研究木霉活性代谢产物的提取条件提供参考，也为研制开发生防木霉制剂和先导化合物提供基础理论依据。1材料和方法1.1试验材料供试菌种：供试木霉为长枝木霉（T.longibrachiatum）SMF2、哈茨木霉（T.harzianum）T39。供试病原菌为引起国槐根茎腐烂病的5种主要致病菌镰刀菌：尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、腐皮镰刀菌（F.solani）、多隔镰刀菌（F.decemcellulare）、木贼镰刀菌（F.equiseti）和F.keratoplasticum，均由聊城大学植物病理实验室提供。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g和蒸馏水1 L；马铃薯葡萄糖培养液（PD）：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g和蒸馏水1 L；察氏培养液（CD）：葡萄糖 20 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.6 g、MgSO47H2O 0.5 g、NaCl 0.1 g、天门冬酰胺5 g、CaCl2 0.1 g和蒸馏水1 L；麦麸培养液（WBM）：麦麸皮40 g、去皮马铃薯 50 g、蔗糖 20 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO47H2O 0.5 g、CaCl2 0.25 g和蒸馏水1 L；燕麦培养液（OM）：燕麦片 40 g 和蒸馏水 1 L；麦芽糖培养液（ME）：麦芽糖20 g和蒸馏水1 L13。上述培养基及5种培养液121 15 min高温灭菌备用。供试有机溶剂：按极性由小到大排列为石油醚（天津市大茂化学试剂厂）、四氯化碳（天津市风船化学试剂科技有限公司）、正丁醇（天津市化学试剂三厂）、乙酸乙酯（烟台远东精细化工有限公司）和三氯甲烷（烟台市双双化工有限公司），均为分析纯。1.2试验方法1.2.1SMF2和T39菌株的活化将斜面上保存的长枝木霉 SMF2 和哈茨木霉T39于PDA培养基上活化，（251）恒温培养箱培养5 d，保存备用。1.2.2代表性镰刀菌的确定取已活化的SMF2和T39，打取菌饼（0.7 cm），分别装入盛有100 mL PD培养液的三角瓶中，1瓶15饼，3次重复，于（251）、180 r/min振荡培养7 d。所得培养液经0.22 m无菌滤膜过滤后，与PDA培养基混匀制成含毒培养基，使滤液终浓度为总体积的60%，以不加滤液的PDA培养基作为对照14。分别接种 5 种镰刀菌菌饼，一皿一饼，3 次重复，于（251）恒温培养箱中培养5 d，观察生长状态，测量菌落直径，计算抑制率。1.2.3最适培养液的筛选配制PD、CD、WBM、OM和ME培养液，分别装入三角瓶，每瓶100 mL，接种SMF2和T39菌饼，1瓶15饼，3次重复，培养条件同上。采用1.2.2中方法，制备含次生代谢产物的含毒培养基，接种1.2.2确定的代谢性镰刀菌（尖孢镰刀菌），培养5 d，测量菌落直径，计算抑制率。1.2.4最佳培养时间的筛选选用1.2.3确定的最适培养液（PD），接种SMF2和T39菌饼，（251）、180 r/min分别振荡培养1、2、3、5、7、9和11 d，采用1.2.2中方法，制备含毒培养基，接种1.2.2确定的代谢性镰刀菌（尖孢镰刀菌），培养5 d，测量菌落直径，计算抑制率。1.2.5最适提取溶剂及提取方法的筛选平行提取法：配制 1.2.3 确定的最适培养液659四川农业大学学报第 41 卷（PD），分别接种 SMF2 和 T39 菌饼，震荡培养 6 d，得到含次生代谢产物的滤液。滤液用供试的5种有机溶剂分别萃取，按滤液有机溶剂=1 3（V/V）比例浸提3次，分别收集有机相和水相，经旋转蒸发直至冷凝管中无溶液滴下，分别得到含 SMF2和T39次生代谢产物的10种提取物原液，制成含毒 PDA 培养基，接种代谢性镰刀菌（尖孢镰刀菌），以添加无菌水的PDA作为对照。3次重复，于（251）恒温培养箱中培养5 d，观察镰刀菌的生长状态，测量菌落直径，计算抑制率和半最大效应浓度EC50。分步提取法：含SMF2和T39次生代谢产物的PD滤液，用供试5种有机溶剂依极性从小到大连续萃取，首先按滤液：石油醚等比例浸提3次，移出有机层，水层进行下一步萃取，溶剂分别为正丁醇，乙酸乙酯、三氯甲烷和四氯化碳，保留最后的水层。浓缩各提取液，分别得到含SMF2、T39次生代谢产物的6种提取物原液，接种代谢性镰刀菌（尖