miR-217靶向调控HMGA 2基因对内质网应激介导的口腔癌细胞自噬与凋亡的影响.pdf

论著m i R-2 1 7靶向调控HMG A2基因对内质网应激介导的口腔癌细胞自噬与凋亡的影响*宿伟鹏1 赵化荣1 李晨曦2 刘攀1 张洋1 龚忠诚2(新疆医科大学第一附属医院1.肿瘤中心;2.颌面肿瘤外科,新疆 乌鲁木齐 8 3 0 0 1 1)【摘要】目的 探究微小R NA 2 1 7(m i R NA-2 1 7)对口腔癌细胞中内质网应激介导的自噬与凋亡的影响及其分子机制。方法 培养人口腔癌细胞和人正常口腔角质形成细胞,实时荧光定量聚合酶链式反应(R T-q P C R)检测细胞中m i R-2 1 7与高迁移率族蛋白 A 2(HMGA 2)表达水平;将人口腔癌细胞系S A S分为对照组、m i R-N C组、m i R-2 1 7 m i m i c组和m i R-2 1 7 m i m i c+4-P B A组4组,脂质体法进行转染和内质网应激抑制剂4-苯丁酸处理后,流式细胞术检测细胞凋亡率,H o e c h s t 3 3 3 4 2染色观察细胞凋亡情况,细胞免疫荧光染色检测细胞中微管相关蛋白1轻链3(L C 3)表达,蛋白质免疫印迹(W e s t e r n B l o t)测定细胞中自噬相关蛋白L C 3 I、L C 3 I I及B e c l i n-1的表达水平,R T-q P C R和W e s t e r n B l o t测定细胞内质网应激相关分子C C AA T/增强予结合蛋白同源蛋白(CHO P)、葡萄糖调节蛋白7 8(G R P 7 8)及天冬氨酸蛋白水解酶-1 2(C a s p a s e-1 2)的表达水平;双荧光素酶报告基因检测实验和W e s t e r n B l o t验证m i R-2 1 7对HGMA 2的靶向作用。结果 与人正常口腔角质形成细胞HNOK比较,人口腔癌细胞H S C 3、S A S、S C C 1 5、F a D u中m i R-2 1 7相对表达量下调而HMG A 2相对表达量上调(P0.0 5);与对照组比较,m i R-2 1 7 m i m i c组S A S细胞凋亡率升高,有大量呈亮蓝色高荧光 的凋 亡 细胞,L C 3荧 光强 度 升高,L C 3-/L C 3-比值 与B e c l i n-1蛋 白 相 对 表 达 量 均 上 调,G R P 7 8、CHO P、C a s p a s e-1 2 mR NA相对表达量与蛋白相对表达量均上调(P0.0 5);而与m i R-2 1 7 m i m i c组比较,m i R-2 1 7 m i m i c+4-P B A组S A S细胞凋亡率下降,呈亮蓝色高荧光的凋亡细胞明显减少,L C 3荧光强度降低,L C 3-/L C 3-比值与B e c l i n-1蛋白相对表达量均下调,G R P 7 8、CHO P、C a s p a s e-1 2 mR NA相对表达量与蛋白相对表达量也均下调(P0.0 5);HM-GA 2与m i R-2 1 7在特定区域存在碱基互补现象,且m i R-2 1 7靶向负调控HGMA 2表达。结论 m i R-2 1 7可能通过促进内质网应激途径诱导口腔癌细胞发生自噬与死亡,其机制可能与靶向负调控HMG A 2表达相关。【关键词】口腔癌;m i R-2 1 7;HMG A 2;内质网应激;自噬;凋亡【中图分类号】R 7 3 9.8 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 3 基金项目:新疆维吾尔自治区卫生计生委青年医学科技人才专项科研项目(W J WY-2 0 2 0 1 7)通讯作者:龚忠诚,主任医师,E-m a i l:k l a s 1 2 3 0 01 6 3.c o m引用本文:宿伟鹏,赵化荣,李晨曦,等.m i R-2 1 7靶向调控HMG A2基因对内质网应激介导的口腔癌细胞自噬与凋亡的影响J.西部医学,2 0 2 3,3 5(9):1 2 5 6-1 2 6 3.D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 3T h e e f f e c t o f m i R-2 1 7 t a r g e t i n g a n d r e g u l a t i n g HMG A 2 g e n e o n e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m s t r e s s-m e d i a t e d a u t o p h a g y a n d a p o p t o s i s i n o r a l c a n c e r c e l l sS U W e i p e n g1,Z H A O H u a r o n g1,L I C h e n x i2,L I U P a n1,Z H A N G Y a n g1,G O N G Z h o n g c h e n g2(1.C a n c e r C e n t e r,T h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 1 1,C h i n a;2.M a x i l l o f a c i a l T u m o r S u r g e r y D e p a r t m e n t,T h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 1 1,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f m i c r o R NA(m i R NA)2 1 7 o n e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m s t r e s s-m e d i-a t e d a u t o p h a g y a n d a p o p t o s i s i n o r a l c a n c e r c e l l s a n d i t s m o l e c u l a r m e c h a n i s m.M e t h o d s H u m a n o r a l c a n c e r c e l l s a n d h u m a n n o r m a l o r a l k e r a t i n o c y t e s w e r e c u l t u r e d.T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f m i R-2 1 7 a n d h i g h m o b i l i t y g r o u p A 2(HMG A 2)i n c e l l s w e r e d e t e c t e d b y r e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n(R T-q P C R).T h e h u m a n o r a l c a n c e r c e l l l i n e S A S w a s d i v i d e d i n t o 4 g r o u p s:c o n t r o l g r o u p,m i R-N C g r o u p,m i R-2 1 7 m i m i c g r o u p a n d m i R-2 1 7 m i m i c+4-P B A g r o u p,a f t e r t r a n s f e c t i o n b y l i p o s o m e m e t h o d a n d t r e a t m e n t w i t h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m s t r e s s i n h i b i t o r 4-p h e n y l b u-t y r i c a c i d.T h e f l o w c y t o m e t r y w a s u s e d t o d e t e c t c e l l a p o p t o s i s r a t e.T h e H o e c h s t 3 3 3 4 2 s t a i n i n g w a s u s e d t o o b s e r v e c e l l 6521西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.9a p o p t o s i s.T h e c e l l i mm u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f m i c r o t u b u l e-a s s o c i a t e d p r o t e i n 1 l i g h t c h a i n 3(L C 3)i n c e l l s.W e s t e r n b l o t w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f a u t o p h a g y-r e l a t e d p r o t e i n s L C 3 I,L C 3 I I a n d B e c l i n-1 i n c e l l s.R T-q P C R a n d W e s t e r n B l o t w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f i n t r a c e l l u-l a r e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m s t r e s s-r e l a t e d m o l e c u l e s C C AA T/e n h a n c e r-b i n d i n g p r o t e i n h o m o l o g o u s p r o t e i n(CHO P),g l u-c o s e-r e g u l a t e d p r o t e i n 7 8(G R P 7 8)a n d a s p a r t a t e p r o t e o l y t i c e n z y m e-1 2(C a s p a s e-1 2).T h e t a r g e t i n g e f f e c t o f m i R-2 1 7 o n HGMA 2 w a s v e r i f i e d b y d u a l-l u c i f e r a s e r e p o r t e r g e n e d e t e c t i o n e x p e r i m e n t s a n d W e