microRNA-124过表达对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响.pdf

554研究论著新医学 2023 年8 月第 54 卷第 8 期microRNA-124 过表达对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响朱键 陈天天 刘智勇 郑常龙【摘要】目的 研究过表达微 RNA-124（miR-124）对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响及初步探索其可能机制。方法 使用野百合碱（MCT）经腹腔注射建立大鼠肺动脉高压模型，气管内滴注腺相关病毒（AAV）介导的 miR-124进行干预，记录大鼠心脏右室收缩压（RVSP）、平均动脉压和心率，实时荧光定量 PCR 法检测大鼠肺组织中 miR-124的表达，van Gieson 染色观察肺内小动脉的重构程度并计算血管外径在 2550 m 以及 51100 m 的肺小动脉的中膜/外径比值，蛋白免疫印迹法检测肺组织中 IL-6 与 p-STAT3 的蛋白水平。结果 miR-124 在肺动脉高压大鼠肺组织中呈低表达；过表达 miR-124 可导致肺动脉高压大鼠 RVSP 下降，肺内小动脉中膜/外径明显降低，肺组织中 IL-6 和p-STAT3 的表达下调。结论 AAV 介导的 miR-124 过表达可明显减轻肺动脉高压的大鼠的 RVSP 以及肺血管重构，其机制可能与下调 IL-6 和 p-STAT3 的表达有关。【关键词】微核糖核酸-124；肺血管重构；肺动脉高压Effect of overexpression of microRNA-124 on pulmonary vascular remodeling in rats with pulmonary arterial hypertension Zhu Jian，Chen Tiantian，Liu Zhiyong，Zheng Changlong.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，ChinaCorresponding author，Zheng Changlong，E-mail:【Abstract】Objective To evaluate the effect of overexpression of microRNA-124（miR-124）on pulmonary vascular remodeling，and to unravel the potential mechanism in rats with pulmonary arterial hypertension（PAH）.Methods In the monocrotaline（MCT）-induced PAH rat models，intratracheal infusion of miR-124 carried by adeno-associated virus（AAV）was performed.The right ventricular systolic blood pressure（RVSP），mean systolic arterial pressure and heart rate were recorded.The expression level of miR-124 in lung tissues of rats was detected by real-time quantitative PCR.The histological morphology of pulmonary arterioles was observed by van Gieson staining.The ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles with vessel diameters in 25-50 m and 51-100 m were calculated.The expression levels of IL-6 and p-STAT3 protein in lung tissues were detected by Western blot.Results The expression level of miR-124 was down-regulated in pulmonary tissues of rats with PAH.RVSP was significantly decreased，the ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles were significantly attenuated，and the expression levels of IL-6 and p-STAT3 proteins were significantly down-regulated by overexpression of miR-124.Conclusion AAV-mediated overexpression of miR-124 can significantly reduce RVSP and pulmonary vascular remodeling in rats with PAH，probably by down-regulating the expression levels of IL-6 and p-STAT3.【Key words】MicroRNA-124；Pulmonary vascular remodeling；Pulmonary arterial hypertension肺动脉高压（PAH）是一种由肺血管重构引起的逐渐加重、病死率较高、预后较差的心血管疾病1。PAH 的一个重要特征是肺微血管床进行性减少、肺小动脉重构进行性增加，导致肺的血管阻力也进行性增加，气血交换减少，缺氧进行性加重，最终导致肺动脉压明显升高和右心衰竭，严重者可致死亡2。目前，临床上针对肺血管张力增加的药物，如磷酸二酯酶抑制剂和内皮素受体拮抗剂，可以缓解部分 PAH 患者的临床症状和改善血流动力学参数，但其作用靶点并不能逆转肺血管重塑，疗效有限，无法有效降低 PAH 患者的病死率3。因此，抑制或逆转肺血管重构的治疗策基金项目：国家自然科学基金（81500287）作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院急诊科（朱键，刘智勇，郑常龙），心胸外科（陈天天）通信作者，郑常龙，E-mail:DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2023.08.005欢迎扫码观看 文章视频简介2023 年8 月第 54 卷第 8 期555新医学 略可能是治疗 PAH 的新方法。微 RNA-124（miR-124）被发现在神经细胞中大量表达、在神经发育中具有重要作用4。既往研究结果表明，miR-124可抑制 PAH 患者的血管平滑肌细胞的增殖，并可降低肺血管成纤维细胞的增殖和迁移5-6。然而，通过腺相关病毒（AAV）介导 miR-124 持续过表达能否有效抑制外膜成纤维细胞和血管平滑肌细胞的异常增殖，从而进一步减轻肺血管重构、治疗 PAH 呢？miR-124 在 PAH 中的作用及其作用机制如何亦尚不明确。因此，本研究拟用 miR-124过表达的方法干预野百合碱（MCT）诱导的 PAH大鼠模型，观察其对 PAH 大鼠肺血管重构的变化，并初步探索其可能的分子机制，为临床治疗 PAH提供动物实验理论基础。材料与方法一、实验动物和试剂Sprague Dawley（SD）雄性大鼠 32 只，无特定病原体（SPF）级，体重 180200 g，购自中山大学动物实验中心，由该中心 SPF 级动物房负责饲养，自由饮水、进食。本研究经中山大学实验动物伦理委员会批准（批件号：IACUC-DB-16-1113），动物实验操作均按国家相关实验动物保护标准和动物使用指南进行。MCT 购自美国 Sigma 公司。磷酸化信号转导和转录激活因子 3（p-STAT3）、STAT3 及 GAPDH抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司，IL-6抗体购自英国 Abcam 公司。AAV-U6-ZsGreen 购自汉恒生物科技（上海）有限公司。二、实验方法1.实验分组与大鼠 PAH 模型的建立32 只大鼠按照随机数字表法分为正常对照（control）组、MCT+生理盐水（MCT）组、MCT+AAV-绿色荧光蛋白（MCT+AAV-GFP）组和 MCT+miR-124（MCT+AAV-miR-124）组，每组 8 只。MCT+NS 组、MCT+GFP 组和 MCT+miR-124 组大鼠经腹腔注射 2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，采用自制气管导管套管插管，分别抽取 100 L 生理盐水、AAV-GFP（滴 度 为 2.01015 vg/L）和 AAV-miR-124（滴度分别为 1.41015 vg/L）通过微量注射器缓慢滴入气管（vg 为病毒基因组）。1 d 后，MCT+NS 组、MCT+GFP 组和 MCT+miR-124 经腹腔注射 MCT（60 mg/kg）制作大鼠 PAH 模型。2.大鼠血流动力学和右心室肥厚指数的监测 MCT 给药后 35 d（实验终点），经腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠后，分离右侧颈内静脉，置入 PE-100 聚乙烯导管，连接换能器测量右心室收缩压（RVSP）以反映肺动脉收缩压。随后分离出右侧颈动脉，置入 PE-50 聚乙烯导管测量平均收缩动脉压（mSAP）和心率（HR）。血流动力学检测后处死大鼠，分离并取出大鼠心脏和肺，4 磷酸盐缓冲液冲洗干净，将左右心房剪去，分别分离出右心室（RV）、左心室及室间隔（LV+S）进行称重（本部分操作由不清楚实验分组的实验员完成以避免主观性偏倚），计算右心室与左心室加上室间隔之和的比值即为右心室肥厚指数（RVHI），RVHI=RV/（LV+S）。3.实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测肺组织中 miR-124 的表达将约 100 mg 大鼠右肺组织剪碎加入 1 mL 含RNA 降解酶的 TRIzol 液中，研磨裂解，随后加入氯仿提取肺组织总 RNA，经纯化后用紫外分光光度法测定 RNA 浓度及纯度。使用 RT-qPCR 试剂盒进行逆转录反应，引物序列见表 1，扩增条件为：50 2 min；95 2 min；95 15 s；60 32 s，40 个循环。PCR 扩增完成后，采用按 2-Ct相对定量计算 miR-124 及内参 U6 RNA 的表达。4.肺动脉组织 van Gieson 染色左肺组织经 4%多聚甲醛-PBS 液中固定，石蜡切片后行 van Gieson 染色，由 2 名研究人员在光镜下观察肺组织病理变化。在高倍镜（400 倍）下观察肺血管形态，对外径在 25100 m 的肺小动脉进行拍照（为避免偏倚，拍照者对实验分组情况不知情）。使用图片处理软件测量肺内小动脉的中膜以及血管外径的长度，计算二者的比值即为中膜/外径比值。每张切片随机选取 1015 个肺小表 1 引物序列 引物名称正向引物反向引物miR-1245-TGCGTGTTCACAGCGGACCT-35-TGGCATTCACCGCGTGCCTT-3U65-CTCGCTTCGGCAGCACA-35-AACGCTTCACGAATTTGCGT-32023 年8 月第 54 卷第 8 期556新医学 动脉，分别选取血管外径在2550 m、51100 m 肺内小动脉，对其中膜/外径比值进行统计分析，以了解不同大小的肺内小动脉重构严重程度。5.蛋白免疫印迹法检测取约 50 mg 大鼠右肺组织，剪碎后加入组织蛋白裂解液裂解，置于冰上反复充分研磨，离心后取上清液，考马斯亮蓝法测蛋白质浓度。按试剂盒说明书步骤操作，分别加入抗 IL-6、GAPDH、STAT3 及 p-STAT3 抗体（均为 1 1 000），4