OECD化学品局部毒性替代方法测试指南最新进展.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2023年8月第4期Aug.2023,No.4专论与综述1www.ffc-*基金项目：中国药品监督管理研究会化妆品监管研究专委会项目（编号2022-Z-H-002）；上海市专业技术服务平台建设项目（编号22DZ2292100）收稿日期：2022-06-16；修回日期：2022-09-06作 者1.上海市疾病预防控制中心，上海 200336；2.国家药品监督管理局化妆品监测评价重点实验室，上海 200336 佘媛媛1,2 崔文广1,2 陈 田1,2#周利红1,2#OECD 化学品局部毒性替代方法测试指南最新进展*摘 要经合组织（OECD）化学品测试指南是评估化学品对人类健康和环境潜在影响的有效工具，被许多国家和地区参考使用。本文对近期 OECD 针对化学品局部毒性检测新纳入的方法（OECD497、OECD498）、更新的方法（OECD439、OECD442C、OECD494），以及更正的方法（OECD405、OECD406）进行了归纳和描述，为替代方法的进一步应用提供参考。关键词替代方法 化学品 局部毒性 经合组织The Latest Progress of the OECD Guidelines of Alternative Methods for Topical Toxicity Testing of Chemicals*SHE Yuanyuan1,2 CUI Wenguang1,2 CHEN Tian1,2 ZHOU Lihong1,2#(1.Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China;2.NMPA Key Laboratory for Monitoring and Evaluation of Cosmetic,Shanghai 200336,China)Abstract:The OECD Guideline for Testing of Chemicals is an effective tool for assessing the potential effects of chemicals on human health and the environment,and is widely used by many countries and regions as a reference.We summarized and described the recently incorporated methods(OECD497,OECD498),the updated methods(OECD439,OECD442C,OECD494),and the corrected methods(OECD405,OECD406)for topical toxicity testing of chemicals,and provided reference for the further application of alternative methods.Keywords:alternative method chemical topical toxicity OECD随着动物试验 3R 原则的推广、欧盟下令全面禁止化妆品动物试验的实施和关于化学品注册、评估、许可和限制的法规（REACH 法规）的影响，越来越多的国家和地区开展了替代方法的研究 1-3。专论与综述佘媛媛，等作 者 简 介佘媛媛（1995），女，硕士，公卫医师，主要从事皮肤健康危害因素监测与控制。#通信作者：陈田（1984），男，博士，高级工程师，主要从事皮肤健康危害因素监测与控制。联系电话：021-62758710E-mail:周利红（1979），女，硕士，主要从事化妆品检测评估研究。联系电话：021-62758710E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0132专论与综述2023 年 8 月香料香精化妆品2www.ffc-其 中，经 济 合 作 与 发 展 组 织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）的经合组织（OECD）化学品测试指南（以下简称指南）在国际上得到了广泛的参考和应用 4。我国替代方法研究起步较晚，在参考国际上较为成熟的方法基础上开展大量的工作 5。近年来，OECD 对部分替代方法进行引入、更新或更正以进一步满足行业需求。以下将针对 2021 年 OECD更新的主要局部毒性替代方法的变化进行阐述。1 新引入的测试指南1.1 OECD497 皮肤致敏的定义方法针对型超敏反应，指南通过使用多类型的组合信息来提供安全信息，从而取代动物试验。方法由特定组合中选定方法（如计算机预测、化学分析、体外数据）组成，使用数学模型等解释程序，最后与大量小鼠局部淋巴结试验（LLNA，OECD429）、人体试验数据进行比较，克服个别方法的某些限制 6。指南主要分为 2 个部分。（1）基于 KE1和 KE2/KE3 关键事件的体外测试 3 选 2（2o3）试验方法，在直接多肽反应试验（direct peptide reactivity assay，DPRA，OECD442C）、ARE-Nrf2荧光素酶试验（KeratinoSensTM，OECD442D）、人源细胞系活化试验（h-CLAT，OECD442E）共 3种方法的结果中选择 2 种对受试物是否具有致敏性进行判定，与 LLNA 和人体试验结果相比较，其准确度、灵敏度、特异度均在 80%以上。（2）基于 KE1、KE3 关键事件以及计算机预测模型的结果对受试物的皮肤致敏性和致敏分级进行判断，判断方法包括 2 种：整合测试策略 1 通过 DPRA、h-CLAT 的试验结果，并结合 DEREK Nexus v6.1.0预测模型进行判定；整合测试策略 2 通过 DPRA、h-CLAT、OECD QSAR Toolbox v4.5 的结果分析、积分，根据积分结果对受试物的致敏性和分级进行判断。这 2 种方法的致敏结果判断准确率，与LLNA 试验结果相比分别为 81%和 80%，与人体试验结果相比均为 69%；致敏分级判断准确率，与 LLNA 试验结果相比均为 71%，与人体试验结果相比分别为 68%和 70%。1.2 OECD498 体外光毒性：重建人表皮光毒性试 验重建人表皮光毒性试验（the in vitro reconstructed human epidermis phototoxicity test，RhE PT）采用3D 人重建表皮模型模拟人皮肤最外层的生化和生理特性，指南结合了 OECD439 中化学物质暴露、细胞生存能力评估方法和 OECD432 的标准化光暴露程序，通过比较是否暴露于无毒性剂量UVA 的细胞毒性情况来判断受试物的光毒性大小 7。由于不需要额外使用代谢激活系统，且在受控条件下能耐受 UVB 的暴露，该方法更适合针对 UVA 暴露的光毒性研究。因此，该方法不但可作为一种独立的光毒性测试方法，还能在受试物溶解度有限或与 OECD432 和 OECD495 的活性氧光反应性测试终点兼容的情况下，与 OECD432 和（或）OECD495 相结合，用于分层测试策略。2 进行更新的测试指南2.1 OECD439 体外皮肤刺激：重建人类表皮测试方法 OECD439 于 2010 年 首 次 发 布，并 分 别 于2015、2021年进行了更新 8。与2015年版本相比较：首先，确定了该方法不适用于农药的体外皮肤刺激性评价。Kolle 等 9比较了多个农药配方的体外与体内皮肤刺激性数据，发现使用该方法与体内试验数据相比较，准确度为 54%，敏感度为 44%，特异度为60%。其次，指南 对1-甲基-3-苯基-1-哌嗪和 1-溴己烷这 2 个熟练度验证物质进行额外说明，避免因供应商不同而影响结果判断。再次，指南在原有的 EpiSkin 测试参考方法的基础上增加了 EpiDerm SIT（EPI-200）；在 4 种市售体外测试方法 EpiSkin、EpiDerm SIT（EPI-200）、SkinEthic RHE、LabCyte Epi-model24 SIT的基础上增加了 3 种，分别为 epiCS、Skin+以及 KeraSkinTM SIT。新引入测试方法的质量参数要求如表 1 所示。最后，新版本对 7 种测试方法的阴性和阳性对照等技术参数进行了额外规定，如表 2 所示。并且，针对首次建立该方法的实验室给出了每种检测方法和熟练程度物质获得的细胞存活率值的指示性范围。详细参数范围见表 3 所示。2.2 OECD442C：针对蛋白质共价结合 AOP 关键事件的化学分析法的皮肤致敏试验指南OECD442C 描述了针对致敏有害结局通路中的分子起始事件即化学品与皮肤组织蛋白亲核中心的共价结合的检测方法，通过受试物与特征多肽共孵育，分析反应液中多肽的消耗情况评估受第 4 期专论与综述佘媛媛，等：OECD化学品局部毒性替代方法测试指南最新进展3www.ffc-表 1 新增测试方法的质量参数要求测试方法验证研究类型QC 最低限值QC 最高限值OD 最低限值OD 最高限值epiCS2016 年欧盟替代方法验证中心科学咨询委员会（ESAC）意见和 2018 年独立同行评审，根据OECD GD220 进行基于性能标准的皮肤刺激试验验证研究ET50=2.0 hET50=7.0 h 0.8 2.8Skin+2016 年 欧 盟 替 代 方 法 验 证 中 心（ECVAM）意见和 2018 年独立同行评审，根据 OECD GD220 进行基于性能的皮肤刺激试验验证研究ET50=4.0 hET50=9.0 h 0.8 2.5KeraSkinTM SIT根据 OECD GD220 进行基于性能标准的验证研究，并于 2020 年进行独立同行评审IC50=1.5 mg/mLIC50=4.8 mg/mL 0.7 1.6注：QC 指质量控制（quality control，QC）；OD 指分析过程中光密度值（optical density，OD）。表 2 现行 7 种测试方法新增技术参数测试方法后孵育 MMT 溶液阴性对照 水或无钙镁磷酸盐缓冲液（DPBS）处理后的平均 OD 值的可接受标准以阴性对照为参照，用阳性对照 质量分数 5%十二烷基磺酸钠溶液（SDS）处理后的平均存活率的可接受标准EpiSkinTM（SM）2 mL 0.3 mg/mL0.6 OD 1.5 40%EpiDermTM SIT（EPI-200）300 L 1 mg/mL0.8 OD 2.8 20%SkinEthic RHETM300 L 1 mg/mL0.8 OD 3.0 40%LabCyte Epi-model24 SIT500 L 0.5 mg/mL0.7 OD 2.5 40%epiCS300 L 1 mg/mL0.8 OD 2.8 20%Skin+300 L 0.5 mg/mL0.8 OD 2.5 40%KeraSkinTM SIT300 L 0.4 mg/mL0.7 OD 1.6 40%注：MTT 指噻唑蓝试验。表 3 现行 7 种测试方法参考物质对应细胞存活率的指示性范围 /%物质名称EpiSkinTM（SM）EpiDermTM SIT（EPI-200）SkinEthic RHETMLabCyte Epi-model24 SITepiCSSkin+KeraSkinTM SIT未分类物质（UN GHS No Category）萘乙酸92.35.2100.78.4104.012.9100.47.699.310.494.617.981.815.0异丙醇88.18.765.616.5101.011.376.77.0976.890.727.576