Neurospora crassa LY03菌株在客家“红菌豆渣”营养物质转化中转录组及转化产物分析.pdf

生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 197Neurospora crassa LY03菌株在客家“红菌豆渣”营养物质转化中转录组及转化产物分析林标声1,2，陈冠羲1，张清霁1，林 彬3，陈小红1,*，黎 英1,*（1.龙岩学院生命科学学院，福建 龙岩 364012；2.龙岩学院生物科技与健康产品工程技术研究中心，预防兽医学与 生物技术福建省高等学校重点实验室，福建 龙岩 364012；3.龙岩市科技局农村与社会发展科，福建 龙岩 364000）摘 要：分析接种Neurospora crassa菌株“红菌豆渣”不同发酵时间的营养成分，通过RNA-seq转录组学测序、实时聚合酶链反应技术和超高效液相色谱-串联质谱非靶标代谢组学联合分析方法寻找影响菌株发酵的主要差异表达基因、关键代谢物和代谢通路，探究其中重要基因cellulase（纤维酶基因）的转录表达情况。结果表明，发酵2 d是“红菌豆渣”营养物质转化的关键时期，基因表达最活跃，cellulase基因表达量也最高，发酵原料豆渣碳水化合物通过“淀粉和蔗糖代谢”、“碳代谢”途径代谢生成D-阿拉伯糖、山梨醇、D-木糖、岩藻糖、亚油酸、-亚麻酸和花生四烯酸等糖醇类和有机酸类化合物；发酵3 d，主要进行氨基酸代谢，豆渣原料中的蛋白质成分通过“氨基酸生物合成”途径生成谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸等各类氨基酸；发酵4 d，主要进行次生代谢产物的生成，发酵原料豆渣中原有的大豆苷、染料木苷、染料木素等成分通过“次生代谢物的生物合成”生成新橙皮苷、番木鳖碱、角鲨烯等具有特殊生理活性的物质，产品菌丝开始老化，出现了一些指示食品腐败的油脂如溶血磷脂酰胆碱（18:4/18:1）、溶血磷脂酰胆碱（18:1）。总体上，“红菌豆渣”接种Neurospora crassa菌株发酵2d是营养物质转化最活跃时期，发酵3d样品成熟，发酵4d样品开始老化、腐败。关键词：Neurospora crassa；红菌豆渣；营养物质；转录组；转化产物Transcriptomic Analysis and Products of Nutrient Transformation in Hongjundouzha,a Traditional Hakka Fermented Okara Food Fermented by Neurospora crassa LY03,during FermentationLIN Biaosheng1,2,CHEN Guanxi1,ZHANG Qingji1,LIN Bin3,CHEN Xiaohong1,*,LI Ying1,*(1.College of Life Science,Longyan University,Longyan 364012,China;2.Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology,Biotechnology and Health Products Engineering Technology Research Center of Longyan University,Longyan 364012,China;3.Agricultural and Social Development Section,Longyan Science and Technology Bureau,Longyan 364000,China)Abstract:Inthisstudy,thenutritionalcomponentsofHongjundouzhainoculatedwith Neurospora crassa atdifferentfermentationtimeswereanalyzed.RNAsequencing(RNA-seq),quantitativereal-timepolymerasechainreaction(real-time PCR)andultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS)-based non-targetmetabolomicswereusedtofindoutthemaindifferentiallyexpressedgenes(DEGs),keymetabolitesandmetabolicpathwaysaffectingthefermentationofthisstrain,andthetranscriptionandexpressionofcellulase,animportantgene,wasexplored.TheresultsshowedthattheseconddayoffermentationwasthekeyperiodforthetransformationofnutrientsinHongjundouzhaandthemostactiveperiodofgeneexpression,wherecellulase expressionwasthehighest.Carbohydratesinokaraweremetabolizedthroughthestarch and sucrose metabolism and carbon metabolismpathwaystoproduceD-arabinose,sorbitol,D-xylose,L-fucose,linoleicacid,gamma-linolenicacidandarachidonicacid.Onthe收稿日期：2022-09-15基金项目：福建省科技厅农业科技引导性项目（2022N0028）；福建省自然科学基金项目（2022J011154）第一作者简介：林标声（1980）（ORCID:0000-0003-3188-1376），男，副教授，博士，研究方向为发酵工程。E-mail:*通信作者简介：陈小红（1979）（ORCID:0000-0001-5041-9289），女，高级实验师，硕士，研究方向为生物技术。E-mail:黎英（1974）（ORCID:0000-0002-4486-0489），女，正高级实验师，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail:198 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程thirdday,aminoacidmetabolismoccurred.Proteinsinokaraweremetabolizedintoglutamate,alanine,valineandotheraminoacidsthroughthe amino acid biosynthesis pathway.Onthefourthday,secondarymetaboliteswereproduced.Daidzein,genisteinandgenistininokaraweretransformedintoneohesperidin,strychnine,squamoloneandothersubstanceswithspecialphysiologicalactivitiesthroughthesecondary metabolite biosynthesispathway.Themyceliabegantoage,lysophosphatidylcholine(LPC)18:4/18:1and18:1,lipidsindicatingfoodspoilage,appeared.Ingeneral,theseconddayoffermentationwasthemostactiveperiodofnutrienttransformationinHongjundouzha.Theproductmaturedonthethirddayoffermentation,andbegantoageandrotonthefourthday.Keywords:Neurospora crassa;Hongjundouzha;nutrients;transcriptome;transformation productsDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220915-143中图分类号：S816.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）14-0197-09引文格式：林标声,陈冠羲,张清霁,等.Neurospora crassa LY03菌株在客家“红菌豆渣”营养物质转化中转录组及转化产物分析J.食品科学,2023,44(14):197-205.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220915-143.http:/LIN Biaosheng,CHEN Guanxi,ZHANG Qingji,et al.Transcriptomic analysis and products of nutrient transformation in Hongjundouzha,a traditional hakka fermented okara food fermented by Neurospora crassa LY03,during fermentationJ.Food Science,2023,44(14):197-205.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220915-143.http:/客家“红菌豆渣”主产于福建省武平县，是以豆渣为原料，经过霉制、发酵，分解出游离氨基酸，去除了豆腥味，加工制成的一种产品表面布满橙红色菌丝、风味独特、口感鲜美，富含膳食纤维、蛋白质和氨基酸等营养成分的当地传统美食1。但“红菌豆渣”不易保存，只能在当地售卖，受到很多不可控的非人为因素所制约，如不能有杂菌的出现、不能密封保存等。红菌只能在自然环境下生长，一旦装入瓶中，即失去鲜活的“生命”，成为死菌就不能食用2。此外，到目前为止，有关“红菌豆渣”在发酵过程中营养物质转化及代谢机制的科学研究较少，成为“红菌豆渣”提高产量、质量，走向标准化、工业化生产的重要制约因素。因此，对“红菌豆渣”微生物发酵特性、主要营养成分的变化及发酵机理机制等亟待进一步深入分析。本团队前期采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基从“红菌豆渣”中已分离得到其主要的发酵菌株LY03，通过形态学观察、18S rDNA鉴定、重测序及框架图测序，已确定其为Neurospora crassa3。此外，研究还发现，Neurospora crassa LY03菌株基因组中存在着丰富的纤维酶基因（cellulase），该基因的转录表达对纤维构成为主的豆渣发酵及营养成分的转化具有重要的意义4-5。因而，本研究在不同发酵时间“红菌豆渣”营养成分分析的基础上，进一步采用RNA-seq转录组学测序6、实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，real-timePCR）技术7、超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）非靶标代谢组学8等现代生物技术寻找影响菌株发酵的主要差异表达基因、关键代谢物和代谢通路，探究cellulase基因的转录表达，对“红菌豆渣”的发酵特性进行深入分析，以获得科学、量化的数据，为提高“红菌豆渣”发酵转化效率及探究其营养成分转化的分子机理提供理论基础，使“红菌豆渣”这一具有地方特色的发酵食品得到更为广泛的发展。1 材料与方法1.1 材料与试剂新鲜豆渣 市购；Neurospora crassa LY