HPLC法测定通窍止痛丸中丹酚酸B含量方法的研究.pdf

522023 年第 4 期（总第 168 期）HPLC 法测定通窍止痛丸中丹酚酸 B 含量方法的研究高秀蕊，孙春艳，胡冬梅，王雁群，吴瑞*，李康民，许丽（山东药品食品职业学院，山东淄博，255000）摘 要：目的：以通窍止痛丸中丹酚酸 B 为检测对象建立 HPLC 法测定的含量。方法：用 AgilentTC-C18（4.6250nm，5.0m）色谱柱；流动相为乙腈-0.05%磷酸（22-78）；流速为 1.0mL/min；柱温为40；检测波长 为 286nm；进样量为 10l。实验结果显示丹酚酸 B 在线性范围 16.43136.90g/mL，其丹酚酸 B 进样量与峰面积呈现良好线性关系，线性回归相关系数 r=0.9999（n=6），该法专属性良好、精密度、稳定性、重复性较高，加样回收率为 98.8%，精密度为 0.1%。结论：本方法操作简单，具有良好的准确性和重现性，灵敏度较高，能够分析测定通窍止痛丸中的丹酚酸 B，可以用于通窍止痛丸主要药效成分丹酚酸 B 的含量测定，为丹酚酸 B 物质的基础研究及临床应用提供质量依据。关键词：高效液相色谱法；通窍止痛丸；丹酚酸 B；含量中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1008-3103（2023）04-0052-04Determination of Salvianolic Acid B in Tongqiao Zhitong Pills by HPLCGaoXiu-rui，SunChun-yan，HuDong-mei，WangYan-qun，WuRui*，LiKang-min，XuLi（ShandongDrugandFoodVocationalCollege，ZiboShandong255000，China）Abstract：Objective：ToestablishaHPLCmethodforthedeterminationofsalvianolicacidBinTongqiaozhitongpills.Methods：AgilentTC-C18（4.6250nm，5.0m）columnwasused.Themobilephaseisacetonitrile-0.05%phosphoricacid（22-78）.Theflowratewas1.0mL/min.Thecolumntemperaturewas40.Thedetectionwavelengthis286nm；Thesamplesizewas10l.Reslts：TheexperimentalresultsshowedthatsalvianolicacidBwasinthelinearrangeof16.43136.90g/mL，andtherewasagoodlinearrelationshipbetweensalvianolicacidBsamplesizeandpeakarea，andthelinearregressioncorrelationcoefficientr=0.9999（n=6）.Themethodhadgoodspecificity，highprecision，stabilityandrepeatability，andtherecoveryratewas98.8%.Theprecisionis0.1%.Conclusion：Themethodissimple，rapid，accurate，reproducibleandsensitive.ItcanbeusedfortheanalysisanddeterminationofsalvianolicacidBinTongqiaozhitongpills.ItcanbeusedforthedeterminationofsalvianolicacidBinTongqiaozhitongpills，andprovidequalitybasisforthebasicresearchandclinicalapplicationofsalvianolicacidB.Keywords：HPLC；tongqiaozhitongpill；salvianolicacidB；content.作者简介：高秀蕊（1970），女，硕士，副教授，主要研究方向为药物分析。0 引言通窍止痛丸是医疗机构制剂，由丹参、川芎、赤芍、桃仁、红花、石菖蒲、菊花、醋郁金、远志、石决明、白芷、炙甘草、干姜、大枣 14 味中药组成，该药剂功能主治疏肝健脾、补泻兼施、寒热互调。其中，君药丹参具有活血化瘀、清心除烦、养心安神等功效1，被誉为“平民贵族”，故昔日有“一味丹参，功同四物（当归、川芎、芍药、地黄）”之称。方中的丹参、川芎为君药，丹参化学成分分为脂溶性成分和水溶性成分两大类，其中丹酚酸 A、B、C、D 为水溶性成分2。中国药典2020 年版第一部记载532023 年 8 月HPLC 法测定通窍止痛丸中丹酚酸 B 含量方法的研究了丹参中丹酚酸 B 含量测定方法及多个含丹参制剂测定丹酚酸 B 含量的方法。因此，本文对通窍止痛丸中的丹酚酸 B 进行了 HPLC 含量测定方法的研究，根据中国药典分析方法验证指导原则3，建立了通窍止痛丸中丹酚酸 B 的 HPLC 含量测定方法。1 仪器与试药表 1 使用的仪器与试药编号 仪器与试药名称型号（纯度）厂家1高效液相色谱仪（HPLC）SPD-20AT岛津2电子天平MS205DU瑞士梅特勒托利多3色谱柱C18（4.6250nm，5.0m）安捷伦4丹酚酸 B111562-201212（95.4%）中国食品药品检定研究院5乙腈（MeCN）色谱纯德国默克6甲醇（MeOH）分析纯7磷酸（H3PO4）分析纯8水纯净水娃哈哈9供试品医院制剂2 方法与结果2.1 色谱条件色 谱 柱 AgilentTC-C18（4.6250nm，5.0m）；检 测 波 长 为 286nm；流 动 相 为 MeCN-0.05%H3PO4（22-78）；柱温为 40；流速为 1.0mL/min；进样量为10l。理论塔板数以丹酚酸 B 计不低于 3000。2.2 溶液制备表 2 试验中常用溶液的制备方法编号溶液名称制备方法1对照品溶液取丹酚酸 B 对照品适量，精密称定，加75%MeOH 制成每 lmL 含 0.05mg 的溶液2供试品溶液精密称取本品约 0.3g 置具塞锥形瓶中精密加入 75%MeOH25mL 称定重量超声处理 30 分钟取出放冷再称定重量用 75%的 MeOH 补足减失的重量摇匀滤过取续滤液3阴性对照溶液按处方比例取处方中的其他味药（除去丹参）制成阴性对照样品照供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液2.3 方法学考察32.3.1 专属性考察精密量取表 2 中各溶液 10l，分别注入液相色谱仪进行测定（色谱图见图 1）。从图 1 看出处方中溶剂和其他味药对测定结果无干扰。图 1 专属性的 HPLC 色谱图（a）对照品色谱图；（b）阴性对照色谱图；（c）样品色谱图2.3.2 精密度试验精密量取 10l 对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样 6 次，计算 RSD%为 0.10%。结果显示方法精密度良好，符合中国药典要求。2.3.3 重复性试验平行制备 6 份供试品溶液，按照本文 2.1 项下500004000030000200001000000 5 10 15 20 25uVmin（a）500004000030000200001000000 10 20 30 40 50 60uVmin（b）500004000030000200001000000 10 20 30 40 50 60uVmin（c）542023 年第 4 期（总第 168 期）的色谱条件进样，用外标法计算含量，平均含量为0.4013%，RSD 为 0.69%。表明该方法的重复性良好。2.3.4 回收率试验精密称取已知含量样品（批号：20200422，丹酚 酸 B 含 量 为 0.4013%）约 0.15g 精 密 加 入 75%MeOH22mL 再 精 密 加 入 对 照 品 溶 液 3mL 摇匀，滤过。平行制备 6 份溶液，精密量取上述溶液各 10l，分别注入 HPLC。外标法计算回收率为98.80%（RSD=1.2%）（见表 3），回收率良好，符合中国药典要求。表 3加样回收率试验结果编号取样量（g）样品中丹酚酸 B 含量（ug）丹酚酸 B 对照品加入量（ug）丹酚酸 B 测得量（ug）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）10.1508605.16636.401239.0599.6198.801.220.1500601.95636.401237.4799.8730.1425571.85636.401192.7997.5740.1530613.99636.401249.4199.8550.1411566.23636.401186.3397.4460.1481594.33636.401221.1798.502.3.5 线性与范围图 2 丹酚酸 B 标准曲线按照表 2中对照品溶液的制备方法制备每 lmL约含0.25mg的对照品贮备液。分别精密量取贮备液 5mL至10mL量瓶，5mL至 20mL量瓶，1mL至 5mL量瓶，3mL至 20mL量瓶，1mL至 10mL量瓶，3mL至 50mL量瓶，用 75%的 MeOH稀释至刻度，摇匀，制成 6种浓度溶液。精密量取上述溶液 10l分别注入 HPLC。以丹酚酸 B的进样量（v）为横坐标，色谱峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程 y=13457x-12421，r=0.9999。试验结果（见表 3）表明，丹酚酸 B浓度在16.43136.90g/mL之间进样量与峰面积呈良好的线性关系（如图 2）。2.3.6 样品稳定性考察取表 2 中供试品溶液，分别在 0h、4h、8h、12h、18h、24h 进样，丹酚酸 B 峰面积的 RSD 为 0.56%，结果 24h 内表明供试品溶液在稳定性良好。2.4 样品的测定取三批供试品，根据表 2 的方法配制三份供试品溶液分别精密量取 10l 注入 HPLC，用外标法计算含量。结果见表 4。表 4 丹酚酸 B 含量测定结果批号含量 1（%）含量 2（%）平均含量（%）含量（mg/袋）202004220.40300.39990.401436.55202004230.40230.40260.402436.26202004240.40160.40340.402536.003 讨论3.1 检测波长的选择通过查阅中国药典2020 年版一部1和文献4-10，含丹参的制剂中丹酚酸 B 的含量检测方法，采用的波长多在 286nm，因此选择 286nm 作为检测波长。3.2 流动相考察通过查阅中国药典2020 年版一部1和文献4-10，测定丹酚酸 B 的含量多采用不同浓度、配峰面积浓度（g/mL）y=13457x-12421R2=0.999920000001800000160000014000001200000100000080000060000040000020000000 20 40 60 80 100 120 140 160552023 年 8 月HPLC 法测定通窍止痛丸中丹酚酸 B 含量方法的研究比的乙腈-磷酸、甲醇-乙腈-甲酸等作为流动相。选用乙腈-磷酸按照不同浓度、不同配比进行考察，综合考虑分离度（R）、拖尾因子（T）、理论塔板数（n）等，选择 MeCN-0.05%H3PO4（22-78）作为流动相。3.3 提取溶剂的考察查阅 中国药典 2020 年版第一部1和文献4-10，分别用 75%MeOH、50%MeOH 及 MeOH 作为提取溶剂进行考察，用 75%MeOH 溶解供试品丹酚酸 B 含量明显高于其他两种溶剂，故确定以 75%MeOH 作为提取溶剂。3.4 超声时间的考察分别超声 20min、30min、40min，结果差异不大，综合考虑确定超声时间为 30min。3.5 取样量的考察分别取供试品 0.15g、0.3g、0