LncRNA PVT1对EIF4A1的表达调控作用及机制研究.pdf

第 2 期农垦医学第 45 卷LncRNA PVT1 对 EIF4A1 的表达调控作用及机制研究金迅郭婷婷孙建伟卢雨林王丹君肖冰琪杜诗尧李冬妹（石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室医学院生化教研室，新疆石河子，832002）【摘要】目的：探讨长链非编码 RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）人浆细胞瘤转化迁移基因 1（PlasmacytomaVariant Translocation 1,PVT1)对真核翻译起始因子 4A1（Eukaryotic Translation Initiation Factor 4A1,EIF4A1）可能的表达调控作用及机制。方法：通过对 MGC-803 细胞 PVT1 基因的表达进行干扰，对其干扰效果进行了鉴定，然后利用 realtime-PCR 和 Western Blot技术对 EIF4A1 基因 mRNA、蛋白水平进行了测定；利用 LncBase Predicted v.2 预测 PVT1 作为分子海绵在分子上吸附的 miRNA；然后用 TargetScan 和 miRTarBase对调控 EIF4A1 表达的 miRNA 进行预测，结合两者结果得出中介 miRNA；进一步通过 LncBase Predicted v.2 寻找 PVT1 与候选 miRNA 结合位点，并通过 GEO 数据库说明候选 miRNA在胃癌中的表达情况；最后从干扰 PVT1表达的细胞中通过 real time-PCR技术测定候选 miRNA的水平。结果：在胃癌细胞 MGC-803 中成功抑制了 PVT1 表达。在 PVT1 表达下调的胃癌细胞中 EIF4A1 的 mRNA和蛋白质的表达水平均下调（0.05）；通过 LncBase Predicted v.2 预测出 277 个 PVT1 可能结合吸附的 miRNA；TargetScan 和miRTarBase数据库预测出 12 个可能调控 EIF4A1 的 miRNA；两者结果取交集，发现 miR-493-3p可能为 PVT1 吸附降低的 miRNA，且 miR-493-3p 可能下调 EIF4A1 的水平；通过 LncBase Predicted v.2 预测出 PVT1 与 miR-493-3p 的结合位点位于染色体的 8:128048475-128048492；通过 GEO 数据库发现 miR-493-3p 在胃癌组织中处于表达下调状态。Real-time PCR结果显示 PVT1 水平降低后 miR-493-3p 水平有所增加（0.05）。结论：LncRNA PVT1 可通过吸附降低miR-493-3p 水平而正向调控 EIF4A1 的表达，miR-493-3p 是 PVT1 调节 EIF4A1表达的关键中间分子，为 PVT1 在胃癌中的作用机制提供线索。【关键词】胃癌；PVT1；EIF4A1；miR-493-3p中图分类号：R735.2文献标识码：ARegulation and Mechanism of LncRNA PVT1 on EIF4A1 ExpressionJIN Xun，GUO Ting-ting，SUN Jian-wei，LU Yu-lin，WANG Dan-jun，XIAO Bing-qi，DU Shi-yao，LI Dong-mei（Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi,832002）【Abstract】Objective:To explore the role and mechanism of Long non-coding RNA(LncRNA)plasmacytomavariant translocation 1(PVT1)to regulate the expression of eukaryotic translation initiation factor 4A1(EIF4A1).Methods:By interfering with the expression of PVT1 gene in MGC-803 cells,the interference effect was identified,and then the mRNA and protein levels of EIF4A1 gene were determined by realtime-PCR and Western Blottechniques.LncBase Predicted v.2 was used to predict miRNAs adsorbed with lncRNA PVT1 as molecular sponge.Subsequently,TargetScan and miRTarBase databases were used to predict the miRNAs that might regulate EIF4A1,and the mediating miRNAs were obtained by combining the two prediction results.Furthermore,LncBase Predictedv.2 was used to find the specific binding sites of PVT1 and candidate miRNAs,and the expression of candidatemiRNAs in gastric cancer was explained through GEO database.Finally,the levels of candidate miRNAs were基金项目：国家自然科学基金项目(82160573)；新疆生产建设兵团指导性科技计划项目(2022ZD084)；国家级大学生创新创业训练计划项目(202210759023)。通讯作者：李冬妹，女，教授，硕士研究生导师，从事胃癌早诊标志物及治疗靶点研究。106 2023 年 4 月第 45 卷第 2 期农垦医学Journal of Nongken MedicineApr.2023Vol.45No.2胃癌（Gastric Cancer，GC）是指原发于胃上皮源性恶性肿瘤，据统计分析，我国乃至全球胃癌的病死率均位于前五1，胃癌患者预后与肿瘤分期有显著相关性，尽早诊疗可极大改善患者预后2。多种恶性肿瘤如直肠癌3、乳腺癌4、宫颈癌5标志物已有较成熟的临床报道，而特征性胃癌标识却鲜有发现。因此，确定 GC 的诊断和预测标记物将有助于患者及时尽早治疗，以最大限度地提高生存率，对胃癌关键分子靶点的探索具有重大价值。长链非编码 RNA(LncRNA)在表观遗传和基因调控过程中发挥着复杂而精确的作用6。而在对癌症的相关研究中，lncRNA 则参与到了癌症细胞产生发展的全过程中7,8。LncRNA 因在组织中具有特异性表达易于检测的特点，因此多种长链非编码 RNA被作为生物靶分子的研究热点9。随着研究成果的出现，lncRNA 可以成为 miR-NA“分子海绵”，通过与 miRNA 互作，降低其对下游分子的抑制作用，从而实现控制作用。如 lncR-NA-m433s1 和 lncRNA-GAS5 可分别作为 miR-433和 miR-21 分子海绵而实现对下游分子的调控10,11。PVT1（Plasmacytoma Variant Translocation 1，PVT1)是长链非编码 RNA（Long non-coding RNA,LncRNA），位于染色体 8q24.21 位置，长度为 1716nt12，是与小鼠浆细胞瘤变异易位基因(Pvt1)同源的lncRNA13。课题组前期在胃癌细胞和组织的研究中发现 PVT1 的上调与胃癌细胞的迁移侵袭有密切关系14,15，进一步研究发现 PVT1 的作用机制可能涉及对真核翻译起始因子 4A1(Eukaryotic TranslationInitiation Factor 4A1,EIF4A1)的影响。肿瘤细胞内的分子调控网络复杂，探索其下游分子具有重大价值。真核翻译起始因子 EIF4A1 是翻译起始复合物的一员，相关研究发现其水平也与胃癌细胞的迁移和侵袭有关16。已有文献报道 EIF4A1 在结直肠癌等肿瘤中表达升高17，提示 EIF4A1 在肿瘤发生发展的机制中也可能发挥了重要作用。因此，本研究主要探讨 lncRNA PVT1 是否能调控 EIF4A1 的表达，并在分子海绵作用中分析可能的调控机制，以期为胃癌的靶向分子治疗提供理论依据。1资料与方法1.1 主要试剂DMEM 细胞培养基、10%胎牛血清、胰酶、青-链霉素均购自 Gibco 公司，SYBR Green real timePCR 试 剂 盒 购 自 Qiagen 公 司，EIF4A1、PVT1、miR-493-3p 引物和 PVT1 干扰质粒均购自上海生工生物公司，具体引物序列见表 1，Lip2000 脂质体购自 Invitrogen 公司。Trizol 购自 Ambion 生物公司，逆转录试剂盒购自 Takara 公司，EIF4A1 抗体购自Santa 公司，山羊抗（兔、鼠）IgG 购自北京中杉金桥公司。表 1EIF4A1、PVT1、miR-493-3p 引物序列1.2 培养细胞常规培养人 GC 细胞系 MGC803 于含 4.5g/L 葡萄糖的 DMEM 中，并添加 10%胎牛血清(FBS)。细胞保存在 37毅C 且 5%CO2的潮湿环境中。1.3 质粒转染与 RNA 干扰胃癌细胞 MGC803 密度均匀且达到 50%70%。lncRNA PVT1 shRNA 干扰质粒由 Sangon,detected by real time-PCR in cells that interfered with PVT1 expression.Results:The expression of PVT1 wassuccessfully interfered in gastric cancer cell MGC-803.The expression levels of EIF4A1 mRNA and protein ingastric cancer cells with PVT1 knockdown were decreased(0.05).A total of 277 miRNAs that might bind toPVT1 adsorption were predicted by LncBase Predicted v.2.TargetScan and miRTarBase database predicted 12miRNAs that might regulate EIF4A1.The intersection of these two results showed that miR-493-3p may be amiRNAwithreducedPVT1adsorption,andmiR-493-3pmaydown-regulatethelevel ofEIF4A1.LncBasePredicted v.2 predicted that the binding site of PVT1 and miR-493-3p was located at 8:128048475-128048492 onchromosome.The GEO database showed that miR-493-3p was down-regulated in gastric cancer tissues.The resultsof real-time PCR showed that the level of mi