HILIC-HPLC法检测三乙烯四胺铜的含量.pdf

Vol.49No.4Journal of Southwest Minzu University(NaturalScienceEdition第49 卷第4期Jul.20232023年7 月西南民族大自然科学版）doi:10.11920/xnmdzk.2023.04.008HILIC-HPLC法检测三乙烯四胺铜的含量廖欣怡，曹雅，杨雅楠，仇丽颖（西南民族大学药学院，四川成都610225)摘要：建立了一种测定三乙烯四胺铜含量的高效液相色谱法.对HPLC法的色谱条件进行了优化：以AgilentZORB-AXRRHILICPlus（4.6 mm10 0 mm,3.5m）为色谱柱，以乙睛-水为流动相进行梯度洗脱，流速为1mL/min，检测波长为2 6 0 nm，柱温为室温.结果表明，三乙烯四胺铜浓度在0.0 5 1.0 mg/mL范围内与峰面积的线性关系良好，线性方程为y=610 x-34901,相关系数r为0.9 9 9 2；平均加样回收率为9 9.0%,RSD为1.43%.此方法操作简单，结果准确，可作为三乙烯四胺铜的含量测定方法。关键词：高效液相色谱法；亲水作用色谱；三乙烯四胺铜；含量测定中图分类号：R927.1文献标志码：A文章编号：2 0 9 5-42 7 1（2 0 2 3)0 4-0 40 8-0 6Determination of triethycopper by HILIC-HPLCLIAO Xing-yi,CAO Ya,YANG Ya-nan,QIU Li-ying(School of Pharmacy,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China)Abstract:A method for the determination of Triethylenetetramine copper was developed and validated.The chromatographicconditions of HPLC method were optimized:Chromatography was developed on an Agilent ZORBAX RR HILIC silica column(4.6 mm 100 mm,3.5 m)with acetonitrile and water as the mobile phase.The flow rate was 1 mL/min and the detectionwavelength was 260 nm.The column temperature was room temperature.The methodological study showed that the calibrationcurve was linear in the range of 0.05 1.0 mg/mL(r=0.999 2).The average recovery was 99.0%with RSD of 1.43%.Thismethod is simple,accurate and suitable for quality of control of Triethylenetetramine copper.Keywords:HPLC;hydrophilic interaction chromatography;triethylenetetramine copper;contents determination三乙烯四胺铜（Triethylenetetramine copper，T E-TA-Cu）是一种由三乙烯四胺（triethylenetetramine,TE-TA)与二价铜经络合反应形成的金属络合物 1，化合物能通过自身的整体转运增加心肌细胞中铜的积累.很多动物及临床实验发现，病理性心肌肥大和心梗发生时存在铜从心脏流失的现象，补充铜后可逆转心肌肥大，也可部分恢复因心梗导致的心脏功能下降问题 12-13.TETA-Cu能促进心脏梗死区和边缘区的铜的积累,修复受损心肌细胞中铜的失衡状态 14.因此TETA-Cu对治疗心肌梗死等缺血性心脏疾病具有较大的潜力.目前，该化合物正处于新药研发初始阶段，尚没有质量控制方法的相关报道.无论是原料药合成、制剂开发,还是药代动力学研究均需要一种对TETA-Cu准确定量的分析方法.截至目前，仅有一篇文献报道了TETA-Cu的检测方法 2 .在这项研究中,采用超高分辨率飞行时间质谱法对TETA-Cu进行定性检测，却没有提到有关TETA-Cu的定量检测方法.该方法虽然灵敏度极高，但仪器价格昂贵，操作复杂且通常需要专人操作，因此不适用于药物的常规定量分析.收稿日期：2 0 2 3-0 2-14通信作者：仇丽颖（19 8 0-），女，副教授，博士，硕士生导师，研究方向：药品质量控制.E-mail：q i u 7 9 9 2 12 6.c o m基金项目：国家自然科学基金项目（8 130 0 10 7）409乙烯四胺铜的含量廖欣怡HPLC法检测三第4期TETA-Cu在2 6 0 nm的紫外波长下有最大吸收，可采用紫外检测器以高效液相色谱法检测.此外，TE-TA-Cu是一种极性很强的水溶性化合物，难以通过RP-HPLC保留和分离，因此本文开发了一种HILIC-HPLC方法用于TETA-Cu的检测分析.HILIC全称亲水作用色谱（Hydrophilic interaction chromatography），是一种能将强极性物质保留下来的分离手段.它通过采用强极性的固定相，并利用水及与水互溶的有机相，如甲醇、乙睛等有机溶剂作为流动相实现对强极性物质的保留和分离.因为这一特性,HILIC色谱柱在有机酸、组胺、水溶性维生素等极性物质的分离有着广泛的应用.这一色谱技术的出现弥补了反相色谱对极性物质保留作用弱、保留时间短的现象.本文采用HILIC-HPLC法测定TETA-Cu的含量，方法简便,快速，准确，为今后TETA-Cu的新药研发提供有价值的质量控制方法，1实验与方法1.1试剂与仪器实验试剂：乙睛（色谱纯，诺尔施科技有限责任公司）、甲醇（色谱纯，诺尔施科技有限责任公司）、戊烷磺酸钠（纯度9 9%，上海阿拉丁公司）、氢氧化钠（纯度9 5%，科隆化学试剂有限公司）、盐酸（分析纯，科隆化学试剂有限公司）、TETA-Cu供试品（自制）、TETA-Cu对照品（自制，含量大于9 9%），实验用水为超纯水.实验仪器：高效液相色谱仪（岛津EssentiaLC-16，配紫外检测器SPD-16,溶液输送单元LC-16）；色谱柱 Agilent ZORBAX RR HILIC Plus（4.6 10 0mm,3.5m）（安捷伦科技有限公司）；AgilentPolarisNH,HPLC column(4.6 250mm,5 m)（安捷伦科技有限公司）;ChromplusCis（4.6 150 mm,5m)（成都思为科学仪器有限公司）；KQ5200DB超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；ME55型电子分析天平（梅特勒托利多科技有限公司）.1.2溶液的制备对照品溶液：精密称定TETA-Cu对照品适量，用水溶解并稀释成不同浓度梯度的标准溶液（0.0 5、0.1,0.2,0.5、1 m g/m L).供试品溶液：精密称取TETA-Cu供试品0.0125g置于2 5mL容量瓶中用水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.5mg/mL的供试品溶液，用于供试品溶液稳定性实验；取不同批次的TETA-Cu，分别精密量取0.0 0 7 5g，置于2 5mL容量瓶中用水溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.3mg/mL的溶液，用于含量测定.1.3色谱条件色谱柱为；以乙腈-水为流动相，梯度洗脱程序为:0 10 min乙腈5%10 0%,10 15min乙腈;紫外检测波长为2 6 0 nm；进样量10 L；流速为1mL/min;柱温为室温；理论塔板数按TETA-Cu峰计应不低于50 0 0，外标法定量.1.4线性、范围、检测限和定量限取“1.2”项下不同浓度梯度的对照品溶液，按照“1.3”项下的条件、按照低浓度至高浓度的顺序进行测定.以TETA-Cu的浓度为横坐标x，色谱峰面积为纵坐标y,绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数；将对照品溶液稀释，以信噪比为10:1时对应的浓度确定为定量限；信噪比为3:1时对应的浓度确定为检测限1.5加样回收试验在已知浓度为0.3mg/mL的TETA-Cu供试品溶液中，分别精密加人对照品适量，配制成低、中、高浓度为0.54、0.6 0.0.6 6 mg/mL的溶液，每个浓度平行制备三份，用“1.3”项下的条件进样检测，记录峰面积,计算回收率和RSD.1.6精密度考察1.6.1重复性精密称取TETA-Cu对照品0.0 0 2 5、0.0 12 5、0.0200g，置于2 5mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到低、中、高浓度为0.1、0.5、0.8 mg/mL的对照品溶液.每个浓度平行制备三份，按照“1.3”项下的条件连续进样，记录色谱图和峰面积，计算峰面积的RSD来考察方法的重复性.1.6.2中间精密度按照“1.6.1”项下方法连续五天配制低、中、高浓度的对照品溶液三份，按照“1.3”项下的条件进样，记录色谱图和峰面积，计算峰面积的RSD来考察方法的中间精密度.1.7专属性考察1.7.1酸水解试验精密称取TETA-Cu供试品0.1g，加人5mL410第49 卷西南民族大自然科学版）0.1mol/L盐酸溶解.室温放置15min后，用稀氢氧化钠中和pH至中性,最后以水稀释至浓度约为1mg/mL的溶液.按照1.3”项下的条件进样，记录色谱图和峰面积1.7.2碱水解试验精密称取TETA-Cu供试品0.1g，加入5mL0.1mol/L氢氧化钠溶解.室温放置15min后,用稀盐酸中和pH至中性,最后以水稀释至浓度约为1mg/mL的溶液.按照“1.3 项下的条件进样，记录色谱图和峰面积.1.7.3高温、高湿、强光照射试验分别将同一批次的TETA-Cu供试品，放置于高温（6 0）、高湿（环境湿度为9 5%）、强光（照射度45005001x）条件下3d，称取适量，用水溶解并稀释至浓度为1mg/mL的溶液.按照“1.3 项下的条件进样，记录色谱图和峰面积.1.8稳定性考察1.8.1供试品溶液的稳定性考察按照“1.2”项下的方法，将新配制的浓度为0.5mg/mL的供试品溶液置于室温下，分别于0.0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h 取样，用“1.3”项下的条件进样检测，记录不同时间下供试品溶液的峰面积并计算RSD1.8.2对照品溶液稳定性考察按照“1.2”项下的方法，将新配制的浓度为0.5mg/mL的对照品溶液置于4的环境中，分别在0.5、1、2、3、4d 取样，用“1.3”项下的条件进样检测，记录不同时间对照品溶液的峰面积并计算RSD.1.9TETA-Cu的含量测定取三份不同批次的TETA-Cu供试品，按照“1.2”项下的方法分别配制成0.3mg/mL的溶液进行含量测定.按照“1.3”项下的条件进样，记录峰面积带入标准曲线计算TETA-Cu含量.2结果与讨论2.1色谱条件的优化TETA-Cu络合物具有高极性和强水溶性的特点.本实验采用3种不同类型的色谱柱对TETA-Cu的洗脱情况进行了筛选（见表1）.首先采用C1s柱，以甲醇-水为流动相，无论怎么改变流动相强度，TETA-Cu在色谱柱上均无保留；采用离子对色谱法在水相中添加离子配体（戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠），并对离子配体的浓度、流动相的pH以及强度进行筛选,TETA-Cu虽然在色谱柱上有保留，但分离度差，如图1a、图1b所示，因此不适用于定量分析.其次,在氨基柱上分别采用甲醇-水、乙-水体系时,无论怎么改变流动相强度TETA-Cu的保留时间均在2 min左右,如图1e所示,说明氨基柱也不能用于TETA-Cu的保留和分离.HILIC色谱柱对于极性强的物质有较好的保留