FOXO3a对子宫内膜癌细胞生物学行为的调控作用和机制.pdf

基金项目：陕西省重点研发计划项目（）作者简介：李帆，女，生，硕士，主治医师，：收稿日期：对子宫内膜癌细胞生物学行为的调控作用和机制李帆，唐阳芳，吴利英（陕西省人民医院妇科，西安 ；西安医学院第一附属医院妇科；西安市人民医院，西安市第四医院妇产科；通讯作者，：）摘要：目的探究 对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期生物学行为的调控作用和分子机制。方法选择 年 月至 年 月陕西省人民医院妇科收治的子宫内膜癌确诊患者 例，收集患者的子宫内膜癌组织及与病灶邻近（距离 ）的正常子宫内膜组织，采用 检测 基因的表达水平，采用免疫组织化学染色法和 检测 蛋白表达水平。正常培养人子宫内膜癌细胞系 和人子宫内膜上皮细胞 ，采用 检测 和 细胞中 的 表达水平，采用 检测 蛋白表达水平。将 细胞分为组：对照组、组、组、组和 组。采用 检测 、和 蛋白表达水平；采用 法和平板克隆形成实验检测细胞增殖水平；采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布。结果与正常子宫内膜组织比较，子宫内膜癌组织中 的 和蛋白表达水平均较低（）。与 细胞比较，细胞中 的 和蛋白表达水平均较低（）。与对照组和 组比较，组 细胞增殖水平和细胞克隆数均升高（），细胞处于 期和 期的比例均降低（），期细胞数量升高（），细胞凋亡水平降低（）。与对照组和 组比较，组 细胞增殖水平和细胞克隆数均降低（），细胞处于 期的比例升高（），期细胞数量降低（），细胞凋亡水平升高（）。与对照组和 组比较，组 细胞中 、和 蛋白相对表达量均降低（），、和 蛋白相对表达量均升高（）。与对照组和 组比较，组 、和 蛋白相对表达量均升高（），、和 蛋白相对表达量均降低（）。结论 通过负向调控抑制 信号通路的激活，进而阻滞细胞周期、促进细胞凋亡和抑制细胞增殖，在子宫内膜癌 细胞中发挥抑癌作用。关键词：；子宫内膜癌；增殖；凋亡；细胞周期；信号通路中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，；，：）：，（），：，（），（），（），（），（），山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 （），（），（），（），（），（），（），（），（），：；子宫内膜癌（，）是女性中第六大最常见的恶性肿瘤，新诊断率以每年 的速度增长 。同时，子宫内膜癌的发病率在高收入国家呈上升趋势，这可能与经济发达国家人群的肥胖率高、缺乏运动、更年期晚和预期寿命延长有关 。子宫内膜癌患者常常伴有高血压、肥胖和 感染等常见合并症 。的手术切除和术后辅助治疗已经成为临床治疗的标准化方案，包括子宫切除术和双侧输卵管卵巢切除术，以及紫杉醇 铂常规化疗 。然而这些常规的治疗方法在晚期患者群体中已显示出临床预后差和复发率高的状况 ，因此揭示 发病分子机制，进一步开发针对不同分期 患者的靶向治疗药物和治疗手段势在必行。叉头盒类 （，）是叉头转录因子 亚家族的成员，广泛表达于各种组织器官，在发育、代谢和致癌等多种生理病理过程中起着至关重要的作用 。研究发现 通过各种机制参与多种细胞过程的调控，例如存活、增殖、凋亡、分化、细胞周期和上皮向间质转化（，）等 。已有研究报道，在结直肠癌、乳腺癌和宫颈鳞癌组织或细胞中 均为低表达，且与癌症进展程度呈负相关 。的重要功能和独特的表达模式赋予了它作为癌症患者的治疗靶点和生物标志物的巨大潜力。目前 在子宫内膜癌中的作用鲜有研究报道，本研究旨在从临床组织层面初步探究 子宫内膜癌组织中的表达水平，以及从细胞水平解析 对子宫内膜癌细胞的作用机制，以期为子宫内膜癌的治疗靶点研究提供新的思路。材料与方法 材料 试剂 完全培养基（含 牛血清和 青霉素 链霉素双抗，）购自苏州海星生物科技有限公司。试剂盒（批号 ）购自美国 公司。、和 委托上海吉玛制药技术有限公司合成。试剂盒（）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。一抗叉头盒类 （，）、细胞死亡调解子（，）、死亡因子配体（，）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（，）、蛋白（，）、蛋白（，）、原癌基因蛋白（，）、磷脂酰肌醇 激酶（，）、磷酸化的磷脂酰肌醇 激酶（，）、蛋白激酶 （，）、磷酸化的蛋白激酶（，）、雷帕霉素靶体蛋白（，）、磷酸化的雷帕霉素靶体蛋白（，）和 二 抗 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 （）均购自美国 公司。细胞凋亡检测试剂盒（）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，细胞周期检测试剂盒（）购自上海碧云天生物技术有限公司。实验细胞人子宫内膜癌细胞系 和人子宫内膜上皮细胞 均购自美国 。方法 临床样本选择 年 月至 年 月陕西省人民医院妇科收治的子宫内膜癌确诊患者 例，收集各位患者的子宫内膜癌组织及与病灶邻近（距离 ）的正常子宫内膜组织，获取的组织经液氮冷冻后于 保存，待制作切片后采用免疫组织化学染色法检测 表达水平。例患者按照国际妇产联盟（）病理分期为期 例，期 例，期 例；病理分级为低分化有 例，中分化有 例，高分化有 例；淋巴结转移 ，阳性 例，淋巴结转移阴性 例。且所有患者的年龄差异无统计学意义。本研究经过陕西省人民医院医学伦理委员会审批通过（）伦审第（）号，所有患者均知情并签署同意书。细胞培养及分组人子宫内膜癌细胞系 和 人 子 宫 内 膜 上 皮 细 胞 采 用 完全培养基培养，更换 次新鲜的培养基，气相培养条件：空气 ，温度为。采用 检测 和 细胞中 的 表达水平，采用 检测 蛋白表达水平。按照研究方案，将 细胞分为 组：对照组，组，组（干扰表达），组和 组（过表达）。组和 组 细胞分别转染 和 ，组和 组 细胞分别转染 和 重组质粒，对照组 细胞不做任何转染处理。转染实验按照 试剂盒所述步骤执行。免疫组织化学染色检测 蛋白表达水平取收集的子宫内膜癌组织和正常的癌旁组织，按照常规石蜡切片制作方法，福尔马林固定后，石蜡包埋切成 厚度切片。然后依次经过二甲苯中脱蜡和乙醇分级再水化，再与 抗原修复液混合煮沸 ，切片冷却后用磷酸盐缓冲溶液（）清洗次。加入 的 溶液静置 封闭处理，然后在 下与 一抗（稀释度 ）孵育过夜；第 天再与生物素标记的二抗山羊抗兔 在 下孵育 ，溶液洗涤 次，然后进行 染色。光学显微镜下观察并拍摄具有代表性的图像。检测 基因表达水平取收集的子宫内膜癌组织和正常的癌旁组织，液氮速冻后，充分研磨至粉状；另分别低温离心收集 和 细胞，以上组织和细胞均采用 试剂盒抽提总 。以总 为模板，采用 完成 合成和 扩增。反应体系 ，反应程序：预变性 ，变性 ，退火 ，延伸 ，个循环。采用 方法计算 的 相对表达量，以 作为内参基因。引物序列，上游：，下游：；引物序列，上游：，下游：。检 测 、和 蛋白表达水平取收集的子宫内膜癌组织和正常的癌旁组织，液氮速冻后，充分研磨至粉状；另分别低温离心收集各组 和 细胞。以上组织和细胞材料均采用 蛋白裂解液处理，然后低温 超速离心 ，取上清采用 法进行蛋白定量。取适量蛋白，经过水浴变性后通过 电泳进行蛋白分离，然后转移至 膜。将膜与 脱脂牛奶在室温下共同孵育 封闭处理后，采用 溶液于摇床震荡洗涤 次，次。将洗涤后的膜与稀释后的一抗于 下孵育过夜处理，一抗 （）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和 （）。洗膜后再加入辣根过氧化物酶标记的二抗 （）在室温孵育 。采用 显影，在凝胶成像系统下曝光，通过 软件分析各个蛋白条带的光密度值。以 作为内参蛋白。检测细胞增殖取各组转染后培养处于对数期的 细胞，消化和离心后加入培养基重悬调整细胞密度至 ，然后各取 细胞液转移至 孔板，继续培养，每组细胞设置 个重复培养孔和 个调零培养孔。分别在培养 ，取各组培养细胞加入 浓度为 的 溶液，然后继续培养 。培养结束后，加入 的 后 孵育 ，采用酶标仪检测波长为 处的吸光度值，并描绘细胞增殖曲线。平板克隆形成实验取各组转染后培养处于对数期的 细胞，消化和离心后加入培养基重悬调整细胞密度至 ，然后各取 细胞液转移至 孔板，加入 的培养基。持续培养 周后，取出培养基，采用 洗涤 次，然后依次无水乙醇固定细胞 ，洗涤 次，加入结晶紫避光下染色处理 ，洗涤后干燥，各组拍照并进行细胞克隆计数和统计分析。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布取各组转染后培养的 细胞转移至 孔板中培养 ，然后加入胰蛋白酶消化处理，离心收集山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期细胞并用 溶液洗涤 次，重新悬浮在 的结合缓冲液中。按照细胞凋亡检测试剂盒说明，依次加入 的 和 的 轻柔混匀后在室温下避光处理 ，然后在流式细胞仪 上机分析细胞凋亡情况。对于细胞周期分布的分析，按照细胞周期检测试剂盒说明，细胞培养 后，离心收集的细胞用 洗涤 次，加入 乙醇固定；再离心除去乙醇，洗涤次，加入 的 染色液，于 下黑暗环境中孵育 ，然后在流式细胞仪 分析 含量分布。细胞凋亡和细胞周期分布均使用 分析数据。统计学分析本研究所有数据采用 软件进行分析，数据表示为平均值 标准差（珋 ）。计量资料的两组间比较采用 检验分析，多组间比较采用单因素方差分析（）或最小显著差异（）检验分析，表示差异有统计学意义。结果 在子宫内膜癌组织和细胞中的表达水平与正常子宫内膜组织比较，子宫内膜癌组织中 的 和蛋白表达水平均降低（，见图 ）。与 细胞比较，细胞中 的 和蛋白表达水平均降低（，见图 ）。干扰和过表达 效率验证与对照组和 组比较，组 细胞中 的 和蛋白表达水平均降低（）；与对照组和 组比较，组 细胞中 的 和蛋白表达水平均升高（，见图 ）。图 子宫内膜癌组织中 表达水平 与 细胞比较，图 子宫内膜癌 细胞中 表达水平 ，与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 干扰和过表达对各组 细胞中 的 和蛋白表达的影响 对子宫内膜癌细胞增殖的影响与对照组和 组比较，组 细胞增殖水平和细胞克隆数均升高（）；与对照组和 组比较，组 细胞增殖水平和细胞克隆数均降低（，见图 ）。与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，实验检测 细胞增殖图 干扰和过表达 对 细胞增殖的影响 对子宫内膜癌细胞周期的影响与对照组和 组比较，组 细胞处于 和 期的比例均降低（），期细胞数量升高（），和 蛋白相对表达量降低（），蛋白相对表达量升高（）；与对照组和 组比较，组 细胞处于 期的比例升高（），期细胞数量降低（），和 蛋白相对表达量升高（），蛋白相对表达量降低（，见图 和图 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 干扰和过表达 对 细胞周期分布的影响 与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 检测干扰和过表达 对细胞周期蛋白表达的影响 对子宫内膜癌细胞凋亡的影响与对照组和 组比较，组 细胞凋亡水平降低（），、和 蛋白相对表达量均降低（）；与对照组和 组比较，组 细胞凋亡水平升高（），、和 蛋白相对表达量均升高（，见图 和图 ）。通过 信号通路影响子宫内膜癌细胞生物学行为与对照组和 组比较，组 细胞中 和 蛋白表达水平升高（）；与对照组和 组比较，组 细胞中 和 蛋白表达水平降低（，见图 ）。，与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 流式细胞术实验检测干扰和过表达 对 细胞凋亡的影响 与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 检测干扰和过表达 对细胞凋亡蛋白表达的影响 与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 检测干扰和过表达 对 信号通路蛋白磷酸化的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 讨论子宫内膜癌是世界范围内女性最常见的恶性疾病之一，在大多数情况下，表现为妇女早期绝经后出血，因此通常在早期阶段被诊断出来。然而，复发性 的临床预后结果通常很糟糕，年总生存率为 。在临床治疗中，手术干预是目前的标准治疗方案，其中手术分期是最为先进。对于局部复发，手术或放疗或两者结合是目前可以选择的方案，但是对于非局部复发性肿瘤通常采用全身治疗，主要包括激素治疗、化疗和 或更新颖的替代方案，如靶向免疫治疗。近年来，多种靶向治疗已被评估用于治疗子宫内膜癌。癌基因及其编码蛋白（）的过表达与子宫浆液性癌显著相关，被认为是阴性预后指标，而曲妥珠单抗就