HPLC-Q-TOF-MS_MS快速筛查蜂蜜中26种生物碱.pdf

2023，32（3）福建分析测试Fujian Analysis&TestingHPLC-Q-TOF-MS/MS快速筛查蜂蜜中26种生物碱王鹭骁，袁文萱，吴娇敏，王 东，方恩华，徐敦明*（厦门海关技术中心，福建厦门361013）收稿日期：2022-12-2基金项目：海关总署科技项目(2020HK223)作者简介：王鹭骁（1979），男，硕士/工程师，研究方向为食品检验。E-mail：通信作者：徐敦明（1977），男，研究员，主要研究方向为食品安全。E-mail：D摘要：基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法（HPLC-Q-TOF-MSMS）技术，建立了快速筛查和分析蜂蜜中26种生物碱的方法。该方法建立了生物碱检测数据库，其中包含 26 种生物碱的一级精确质量数及保留时间和二级离子谱库。样品采用QuEChERS法提取，加入PSA固相萃取粉末净化，采用，ACE Excel C18-AR（4.6150 mm，2.7m）色谱柱进行分离，5 mmol/L甲酸铵水溶液（含0.1%甲酸）和乙腈作为流动相梯度洗脱，外标法定量。结果表明：26种生物碱在0.550 ng/mL的线性范围内关系良好，相关系数（r）均在0.99以上（），样品回收率在79.7%94.3%，相对标准偏差RSD在1.54%6.93%。检出限0.66.0 g/kg，定量限2.0 20 g/kg。本方法前处理操作简单、高效，为生物碱残留的快速筛查和定量检测提供了可靠的技术支持。关键词：高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF/MS）；蜂蜜；生物碱中图分类号：TS207.3文献标识码：A文章编号：1009-8143（2023）03-0001-08Doi:10.3969/j.issn.1009-8143.2023.03.01Rapid screening of 26 alkaloids in honey by HPLC-Q-TOF-MS/MSWang Lu-xiao，Yuan Wen-xuan，Wu Jiao-min，Wang Dong，Fang En-hua，Xu Dun-ming*（Xiamen Customs Technical Center，Xiamen，Fujian 361013，China）Abstract:A method for the fast screening and detection of 26 alkaloids in honey was established based on high performanceliquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry（HPLC-Q-TOF-MSMS）.The method established adatabase for the detection of alkaloids，which contained the exact mass numbers and retention times of 26 alkaloids at primary level and a secondary ion spectrum library.The samples were extracted by QuEChERS method，cleaned up by addingPSA solid phase extraction powder，and separated by an ACE Excel C18-AR（4.6150 mm，2.7 m）with aqueous solution（containing 0.1%formic acid and 5 mmol/L ammonium formate）and acetonitrile as the mobile phase.External standardmethod was used for quantitative analysis.The results showed that the 26 alkaloids had good linear relationships within0.550 ng/mL，and the correlation coefficients（r）were all above 0.99，the sample recoveries were in the range of 79.7%94.3%，and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 1.54%6.93%.The limits of detection were 0.66.0 g/kg and the limits of quantification were 2.020 g/kg.The method is simple，efficient and provides a reliable technical support for the rapid screening and quantitative determination of alkaloid residues.Key words：high performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry（HPLC-Q-TOF/MS）；honey；alkaloids生物碱是一类碱性的含氮化合物1，其结构复杂，种类繁多，在自然界中广泛存在于药用植物中，因此也被称为植碱。天然的生物碱具有广泛的生理活性和碱性2，在医药3-4、化工5、农畜牧业3等领研究报告12023，32（3）福建分析测试研究报告域广泛运用。但由于很多生物碱本身具有较强的毒性，使用不当易威胁生命健康，譬如：秋水仙碱、乌头碱类的治疗剂量和中毒剂量非常接近，稍微使用过量就可以引发中毒3；常存在于菊科、豆科等植物中的吡咯里西定生物碱，具有肝毒性、基因毒性和致癌性6-7，可以通过食物链进入动物源性食品（牛奶、蜂蜜等），极易对食用人群产生危害6-7。蜂蜜在我国使用历史悠久，作为食品，可以用来为增添风味，作为药品，可以用于脘腹虚痛、肺燥干咳、长燥便秘、，解乌头类药毒；外治疮疡不敛、水火烫伤8。但蜂蜜的品质与与蜜蜂采食的蜜源植物有着直接关系9，若过蜜源植物中含有毒性成分，则蜜蜂采食后将毒性成分带入蜂蜜中，对食用这带来安全隐患。2005年以来，云南省内连续发生了人使用蜂蜜的中毒事件数十起，导致七十多人中毒，18人死亡10；而在国外也有GRIFFIN也对澳大利亚的59份蜂蜜进行检测，其中发现41份样品还有吡咯里西啶类生物碱（PAs）10。鉴于蜂蜜是人类长期服用的食品，且作为摄入生物碱的主要途径之一，需要亟需建立检测蜂蜜中生物碱的方法。目前，现行的标准在蜂蜜中生物碱的检测方面并没有相应的国家标准，仅有一个 T/SATA035-2022团体标准11，其中仅涉及21种生物碱，且在操作步骤并未提及净化过程，采用该方法会造成色谱柱的堵塞。目前对于蜂蜜中的生物碱的研究集中在PAs类化合物，种类单一，且大部分采用的净化方法为固相萃取，操作繁杂，时间成本增加，且采用的方法多为为质谱/质谱法。液相色谱-质谱/法12-13相较而言适配性更广、灵敏度更高，因而成为检测手段的日常首选。但三重四级杆串联质谱多采用多反应检测扫描模式（MRM），但在分辨率和扫描速率方面受到限制，在样品分析时会受到基质干扰成分的影响，出现假阳性和假阴性的结果。近些年，高分辨质谱技术在蔬菜水果、茶叶、酒类等领域应用广泛，而在蜂蜜基质的报道中，利用高分辨质谱的的分析检测报道相对较少。本研究针对蜂蜜基质的特点，借助商业化QuEChERS前处理方法，采用PSA固相萃取粉末净化，建立了蜂蜜中26种生物碱的高效液相色谱法-四极杆-飞行时间质谱快速定性筛查法，该方法可在无标准的情况下，快速定性鉴定蜂蜜中26种生物碱的情况，还可以通过HPLC-Q-TOF/MS准确定量，确实做到缩短排查时间、降低实验误差，具有高通量、高效、简便等特点，为蜂蜜产品中的生物碱的安全风险评估提供了技术支持。1实验部分1.1主要仪器与设备Agilent Infinity 1290-6540 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪：配有双电喷雾离子源（dualJetStream ESI），MassHunter PCDL（Personal Compound Database and Library）Manager个人化合物数据库与谱图库创建软件（美国Agilent公司）；离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；涡旋混匀器（德国IKA公司）；BS2202S分析天平（德国Sartorious公司）；氮吹仪（瑞典Biotage公司）1.2主要材料与试剂乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱纯，德国默克股份两合公司）；PSA粉末、QuEChERS盐包（美国安捷伦公司）；实验用水均为Milli-Q超纯水。26种标准品均购自于上海安谱科学仪器有限公司，中英文名称及CAS号详见表1。1.3试验方法1.3.1色谱条件色 谱 柱：ACE Excel C18-AR（4.6150 mm，2.7 m），流动相A：0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈。流动相洗脱程序：0.01.5 min，8%B；1.53.0 min，8%40%B；3.05.0 min，40%80%B；5.08.0 min，80%100%B；8.010 min，100%B；1010.2 min，100%8%B；10.216 min，8%B。柱温：35；进样量：5.0 L；流速：0.8 mL/min。质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子；干燥气温度280；干燥气流速10 L/min，雾化气压力35 psi，鞘气温度260，鞘气流速10 L/min，毛细管电压4000 V，碎裂电压60 V，锥孔电压45 V。全扫描质核比范围为 m/z 501000，扫描速率为 3spectra/s；采用内标参比溶液对仪器质量精度进行实时校正，内标参比溶液包含参比离子精确质量数为121.058 73和922.009 798。1.3.2样品前处理准确称取1.0 g蜂蜜于50mL离心管中，加入3 mL二次水，加入100uL甲酸，加入5 mL乙腈，混匀，超声提取10min，8000 r/min离心3min，提取上清液，再22023，32（3）表126种生物碱的谱库数据Number序号1234567891011121314151617181920212223242526Compound化合物槟榔碱Arecoline苦参碱Matrine野百合碱Monocrotaline槐定碱Sophoridine毛果芸香碱Pilocarpine盐酸麻黄碱Ephedrine千里光碱Senecionine东莨菪碱Scopolamine毒扁豆碱Eserine钩吻碱Gelsemine free base番木鳖碱Brucine阿托品Atropine龙葵碱/茄碱Solanine去氢骆驼蓬碱Harmine金雀花碱Cytisine四氢药根碱Tetrahydrojatrorrhizine秋水仙碱Colchicine原阿片碱Protopine小檗碱Berberine荷叶碱Nuciferin喜树碱Camptothecin新乌头碱Mesaconitine次乌头碱Hypaconitine乌头碱Aconitine吴茱萸碱Evodiamine草乌甲素Bulleya conitineFormula分子式C8H13NO2C15H24N2OC16H23NO6C15H24N2OC11H16N2O2C10H15NOC18H25NO6C17H21NO4C15H21N3O2C20H22N2O2C23H26N2O4C17H23NO3C45H73NO15C13H12N2OC11H14N2OC20H23NO4C22H25NO6C