贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅生长、消化及免疫的影响.pdf

D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 1 2 7第4 2卷第4期2 0 2 3年7月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.4J u l.2 0 2 3贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5对泥鳅生长、消化及免疫的影响孟文蓉1,米浩宇1,黄怡忱1,黄志发1,刘琪彤2,夏梦婕2,房耀维2(1.江苏海洋大学 海洋科学与水产学院,江苏 连云港2 2 2 0 0 5;2.江苏海洋大学 食品科学与工程学院,江苏 连云港2 2 2 0 0 5)摘 要:为探究饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5对泥鳅幼鱼生长、消化及非特异性免疫的影响,选取3 6 0尾初始平均体质量为(3.2 40.1 4)g的泥鳅幼鱼,分为4组,每组3个平行,对照组及3个试验组分别饲喂添加0、11 06、11 07、11 08c f u/g贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5的日粮,养殖8周。试验结果显示:贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5显著提高了泥鳅幼鱼的质量增加率和特定生长率(P0.0 5);随着添加量的增加,蛋白酶、淀粉酶活性先升后降,并在11 07c f u/g组达到最大值,脂肪酶活性则不断升高;11 06c f u/g组泥鳅前肠、中肠形态指标提升效果最显著,11 07c f u/g组后肠形态最佳;相较于对照组,试验组血清过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶活性显著提高,丙二醛含量显著降低(P0.0 5);贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5还显著降低了嗜水气单胞菌攻毒后泥鳅幼鱼的死亡率(P0.0 5)。综上,饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5能够显著促进泥鳅幼鱼生长,提高其消化酶、抗氧化酶活性,改善其肠道形态,提升其非特异性免疫及对嗜水气单胞菌的抗病力。关键词:泥鳅;贝莱斯芽孢杆菌;生长性能;消化;非特异性免疫中图分类号:S 9 6 5.1 9 9文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 4-0 7 1 2-0 7收稿日期:2 0 2 1-0 7-1 2;修回日期:2 0 2 2-0 3-2 3.基金项目:国家自然科学基金资助项目(3 1 7 7 2 0 1 6);江苏省第五期“3 3 3工程”项目(B R A 2 0 1 9 2 4 3);江苏省海洋科技创新项目(HY 2 0 1 8-1 0,J S Z RHY K J 2 0 2 0 0 8).作者简介:孟文蓉(1 9 8 8),女,硕士研究生;研究方向:水产动物营养与饲料.E-m a i l:mw r v e r a1 6 3.c o m.通信作者:房耀维(1 9 7 8),男,教授,博士;研究方向:水产动物营养与饲料、食品生物技术.E-m a i l:f o r o e i 1 6 3.c o m.泥鳅(M i s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u s)是包括我国在内的亚洲国家的重要淡水养殖品种,其味道鲜美、营养丰富,素有“水中人参”的美誉。近年来,随着规模化养殖的不断推进,使用抗生素导致药物残留等食品安全问题日益突出,严重影响了产业健康发展。目前,禁止抗生素作为动物饲料添加剂应用已逐步成为世界各国的共识,因此寻找及研发安全、无毒、无副作用的抗生素替代品成为泥鳅养殖的必然选择1。在若干替代品中,益生菌因其无毒、无抗药性、无残留等优点引发广泛关注。贝莱斯芽孢杆菌(B a c i l l u sv e l e z e n s i s)是芽孢杆菌属的新物种,2 0 0 5年R u i z-G a r c a等2自西班牙南部马拉加贝莱斯河采集的苦咸水样品中分离并首次命名,2 0 0 7年其因认定与解淀粉芽孢杆菌(B.a m y l o l i q u e f a c i e n s)同物异名而被取消合法命名3,2 0 1 6年经全基因组比较,其重新获得合法名称4。贝莱斯芽孢杆菌能够分泌多种消化酶、脂肽、聚 酮 和 抗 菌 蛋 白,对 哈 维 氏 弧 菌(V i b r i oh a r v e y i)、嗜水气单胞菌(A e r o m o n a sh y d r o p h i l a)、无乳链球菌(S t r e p t o c o c c u sa g a l a c t i a e)、大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i)和 沙 门 氏 菌(S a l m o n e l l al i g-n i e r e s)等水产常见致病菌具有抗菌活性5-8,因此具备成为水产饲料益生菌的潜力。已有研究成果表明,贝莱斯芽孢杆菌能不同程度促进珍珠龙胆石斑鱼(E p i n e p h e l u sl a n c e o l a t u sE.f u s c o g u t t a t u s)9、斑点叉尾(I c t a l u r u sp u n c t a t u s)1 0、大西洋鲑(S a l m os a l a r)1 1、仿刺参(A p o s t i c h o p u sj a-p o n i c u s)1 2、鲫(C a r a s s i u sa u r a t u s)1 3等的生长性能、免疫表达和抗病能力。笔者通过在泥鳅饲料中添加不同水平的贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5,研究其对泥鳅生长性能、肠道消化酶活性及形态、抗氧化能力和非特异性免疫的影响,以期为泥鳅规模化养殖的病害防御和促进生长提供基础资料。1 材料与方法1.1 试验材料与条件试验用贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5、攻毒用嗜水气单胞菌为本实验室从土壤、泥鳅病体中分离所得。泥鳅购自江苏连云港赣榆养殖技术服务中心,室内暂养并禁食2 4h后选取初始平均体质量为(3.2 40.1 4)g的泥鳅共3 6 0尾。参照T h u r l o w等1 0的方法,将保存的贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5活化培养,用无菌生理盐水调整至密度为51 09c f u/m L的浓缩制剂。按照0、11 06、1 1 07和1 1 08c f u/g的剂量设计,将菌剂用无菌生理盐水按比例稀释后,等量喷洒至基础饲料中,并用3%鱼油均匀包裹,充分搅拌后自然阴干,4种饲料分装,4保存备用。嗜水气单胞菌经T S B培养基活化培养后,用无菌生理盐水稀释至2.0 1 07c f u/m L。1.2 试验设计与管理3 6 0尾泥鳅随机分配到1 2个聚氯乙烯鱼缸中,设置1个对照组和3个试验组,每组3个平行,每个平行3 0尾。对照组饲喂仅添加无菌生理盐水和鱼油的饲料,试验组分别饲喂含11 06、11 07、11 08c f u/g贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5的日粮。试验期间水温(2 61),p H6.97.3,溶解氧质量浓度(6.4 0.4)m g/L,氨氮质量浓度0.0 6m g/L,亚硝态氮质量浓度0.0 2m g/L。日换水3 0%,日投喂2次(7:0 0、1 8:0 0),投喂量约为其体质量的3%,并根据各水族箱实际情况适量调整,养殖周期为8周。1.3 样品采集与测定1.3.1 样品采集与保存养殖试验结束并禁食2 4h后,统计各鱼缸内泥鳅总数并称量质量。每组随机选取1 5尾泥鳅(每个平行5尾),间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉后,取9尾于尾静脉处采血,每个平行的3尾血样混合后,离心分离血清,-8 0冰箱保存,用于血清抗氧化、免疫指标测定;采血后冰上无菌解剖取肠道组织,剔除表面脂肪后装入无酶离心管中,用液氮迅速冷冻后置于-8 0 保存,用于肠道消化酶测定;剩余每组6尾鱼,冰上解剖并剪取前肠、中肠、后肠,磷酸盐缓冲液清洗干净后固定,每个平行样品混合保存,用于组织学研究。1.3.2 生长性能测定成活率(RS,%)、质量增加率(wWGR,%)和特定生长率(RS G,%/d)按下式计算:RS=nt/no1 0 0%wWG R=(mt-m0)/m01 0 0%RS G=(l nmt-l nm0)/t1 0 0%式中,nt为终末数量(尾),n0为初始数量(尾),mt为终末体质量(g),m0为初始体质量(g),t为试验时间(d)。1.3.3 消化酶测定将液氮冷冻保存的肠道样品取出,冰浴匀浆后离心,取上清液用南京建成生物工程研究所试剂盒测定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。1.3.4 肠道形态测定取出固定后,将肠组织乙醇梯度脱水、二甲苯脱醇、浸蜡包埋、切片、烘干和染色。每组前肠、中肠、后肠分别做3个以上切片,选取绒毛完整走向平直 的 切 片6张,1 0 0倍 视 野 观 测 拍 照,使 用P r o P l u s6.0处理图像,分别测量绒毛高度、绒毛宽度、肌层厚度、肠壁厚度。1.3.5 抗氧化及非特异性免疫指标测定血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、溶菌酶活性和丙二醛含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。1.3.6 感染试验剩余的泥鳅中每组挑选3 0尾(每个平行1 0尾)继续饲喂。稳定5d后,根据攻毒前经预试验确定的半致死量,腹腔注射2.01 07c f u/m L嗜水气单胞菌0.1m L,对照组泥鳅腹腔注射等量无菌生理盐水。周期为1 5d,观察并记录泥鳅的发病和死亡情况。累积死亡率(RCM,%)按下式计算:RCM=nm/nc1 0 0%式中,nm为死亡数量(尾),nc为攻毒数量(尾)。1.4 统计分析数据采用平均值标准差表示,对同一时间点不同试验组的数据进行单因素方差分析,应用邓肯多重比较检验各组数据之间的差异性。通过软件S P S S1 7.0进行数据统计与分析,P0.0 5表示差异显著。2 结果与分析2.1 贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5对泥鳅幼鱼生长的影响与对照组相比,试验组贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5显著提高了泥鳅幼鱼的终末体质量、质量增加率和特定生长率(P0.0 5);11 08c f u/g添加组泥鳅幼鱼成活率显著高于对照组(P0.0 5)(表1)。2.2 贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5对泥鳅幼鱼消化酶活性的影响各组泥鳅幼鱼肠道消化酶活性测定结果见表2。试验组泥鳅幼鱼肠道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均显著高于对照组(P0.0 5);随着贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5添加量的增加,蛋白酶、淀粉酶活性先升后降,在11 07c f u/g添加组达到最大值,脂肪酶活性则不断升高,且各组间差异显著(P0.0 5)。317第4期孟文蓉等:贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5对泥鳅生长、消化及免疫的影响表1 饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌M S P 0 5对泥鳅幼鱼生长的影响 T a b.1 E f f e c t s o fd i e t a r yB.v e l e z e n s i sM S P 0 5o ng r o w t ho f j u v e n i l e l o a c hM.a n g u i l l i c a u d a t u s添加量/c f ug-1A d d i t i o na m o u n t初始体质量/gI n i t i a l b o d yw e i g h t终末体质量/gF i n a l b o d yw e i g h t质量增加率/%W e i g h tg a i nr a t e特定生长率/%d-1S p e c i f i cg r o w t hr a t e成活率/%S u r v i v a l r a t e03.2 70.1 86.6 70.3 1a1 0 4.5 41 2.8 7a1.2 70.1 1a9 1.1 11.9 2a11 063.2 30.1 41 0.6 50.7 5b2 3 0.7 13 5.9 1b2.1 30.1 9b9 5.5 61.9 2a b11 073.1 90.1 71 0.2 61.1 5b2 2 0.9 32 6.5 7b2.0 80.1 6b9 5.5 61.9 2a b11 083.2 70.0 61