Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究.pdf

畜牧与饲料科学秦海霞,韩菲，戴研平，等.Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究 J.畜牧与饲料科学,2 0 2 3,44(4):17-21.D01I:10.12160/j.issn.1672-5190.2023.04.003Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究Animal Husbandry and Feed Science2023,44(4):17-21秦海霞,韩菲1,戴研平,刘改萍1（1.乌兰察布医学高等专科学校组胚教研室，内蒙古乌兰察布0 12 0 0 0;2.岳阳职业技术学院临床医学院，湖南岳阳414000)摘要：目的 探讨亚慢性砷染毒对大鼠睾丸间质细胞Caspase-9蛋白表达的影响。方法 将40 只健康成年清洁级SD雄性大鼠随机分为4组，分别为对照组以及低、中、高剂量染毒组，每组10 只。采用自由饮水方式进行染毒，低、中、高剂量染毒组亚砷酸钠的染毒剂量分别为2.4、12、6 0 mg/L,对照组给予生理盐水,染毒试验持续14周。染毒试验结束后，检测大鼠外周血白细胞数量；采用ELISA法检测大鼠血清TNF-及IL-1的浓度；利用透射电镜观察大鼠精子的超微结构；应用免疫组化法检测大鼠睾丸间质细胞Caspase-9蛋白的表达定位及表达水平。结果 与对照组相比，中、高剂量染毒组大鼠血清中TNF-、I L-1浓度及白细胞计数均显著(P0.05)升高。透射电镜下,对照组精子顶体结构完整,厚度及染色均匀；低剂量染毒组可见精子胞膜肿胀，核染色质较均匀；中剂量染毒组精子顶体与核分离，胞膜肿胀；高剂量染毒组精子尾部中断，轴丝排列紊乱。免疫组化法分析表明,Caspase-9蛋白主要表达于睾丸间质细胞的细胞质，表达信号呈棕褐色；与对照组相比，各剂量染毒组大鼠睾丸组织内Caspase-9蛋白的表达水平均显著(P0.05)升高。结论 睾丸间质细胞Caspase-9蛋白表达水平升高可能是亚砷酸钠致雄性大鼠慢性生殖毒性的机制之一。关键词：亚慢性砷中毒；睾丸间质细胞；超微结构；Caspase-9蛋白；大鼠中图分类号：S859.87;R114Expression of Caspase-9 Protein in Leydig Cells of Rats with Sub-chronic ArsenicPoisoningQIN Haixia,HAN Fei,DAI Yanping*,LIU Gaiping(1.Department of Histology and Embryology,Ulanqab Medical College,Ulanqab 012000,China;2.Department of ClinicalMedicine,Yueyang Vocational and Technical College,Yueyang414000,China)Abstract:Objective This study was conducted to investigate the effects of sub-chronic arsenic poisoning on the expression ofCaspase-9 protein in leydig cells of rats.Method A total of 40 healthy adult clean-grade male SD rats were randomly assignedinto the following 4 groups:a control group and the low-,medium-,and high-dose arsenic exposure groups,with 10 rats in eachgroup.The rats in the low-,medium-,and high-dose arsenic exposure groups were given sodium arsenate by drinking water atconcentrations of 2.4,12 and 60 mg/L,respectively,and those in the control group was given physiological saline.The exposuretest lasted for 14 weeks.Following the exposure test,the number of peripheral white blood cells of the rats was counted;the serumlevels of TNF-and IL-1 were measured by ELISA assay;the ultrastructure of sperm was observed using transmission electronmicroscopy;the expression level and localization of Caspase-9 protein in leydig cells were assessed by immunohistochemicalmethod.Result Compared with the control group,the serum levels of TNF-and IL-1 as well as the number of peripheral whiteblood cells in the medium-and high-dose arsenic exposure groups significantly(P0.05)increased.Under transmission electronmicroscopy,the sperm acrosome structure in the control group was intact,with uniform thickness and staining.In the low-dosearsenic exposure group,the sperm membrane swelled and the nuclear chromatin was uniform.In the medium-dose arsenicexposure group,the sperm acrosome and nucleus split,and the membrane swelled.In the high-dose arsenic exposure group,the收稿日期：2 0 2 3-0 5-2 4sperm tail disrupted and the axial filament arrangementdisordered.Immunohistochemical analysis showed that项目来源：内蒙古自治区高等学校科学研究项目“砷对大鼠睾Caspase-9 protein mainly expressed in the cytoplasm of丸组织水通道蛋白-7、Survivin影响的研究”leydig cells,and the expression signal was dark brown.(NJZY19335)。Compared with the control group,the expression level of作者简介：秦海霞（19 7 6 一），女，讲师，硕士，主要从事生殖Caspase-9 protein in the testicular tissue in all the arsenic学研究工作。通信作者：韩菲（19 8 7 一），女，副教授，硕士，主要从事生殖学研究工作。文献标志码：A文章顺序编号：16 7 2-519 0(2 0 2 3)0 4-0 0 17-0 5exposure groups significantly（P 0.0 5）in c r e a s e d.Conclusion The increased expression level of Caspase-918proteininlaydig cells may be one ofthemechanisms underlying chronicreproductivetoxicity induced by sodium arsenite inmalerats.Keywords:sub-chronic arsenic poisoning;leydig cell;ultrastructure;Caspase-9 protein;rat砷是一种生殖毒物，当达到一定浓度时，具有较强的雄性生殖毒性 1-2 。砷可损伤生精细胞,引起精子数量和质量的下降 3。在精子发生过程中，各级生精细胞都会发生调亡，它是机体清除过量或异常生精细胞的一种重要方式。越来越多的研究证实天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在细胞凋亡中起重要作用 4-6 。Caspase-9是线粒体介导的调亡途径中的关键启动子，在大鼠的Leydig细胞表达 7 。从线粒体释放的细胞色素C与Caspase-9、凋亡蛋白酶激活因子1结合形成复合物后激活Caspase-9，活化的Caspase-9剪切并激活Caspase-3,进而促进细胞凋亡 8-。该研究通过建立亚慢性砷中毒大鼠模型，利用透射电镜观察附睾精子的超微结构，检测睾丸组织中Caspase-9蛋白的表达，探讨砷致生殖系统损害的机制，以期为进一步研究砷的生殖毒理学特征提供参考。1材料与方法1.1 试验材料1.1.1实验动物健康清洁级10 周龄雄性SD大鼠40 只，体重为16 0 2 2 0 g，由贵州医科大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCK（黔)2 0 0 2-0 0 0 1。饲养环境温度为2 0 2 5，相对湿度为6 0%6 5%，正常光照。试验期间，实验动物可自由采食和饮水。1.1.2主要药物与试剂亚砷酸钠，分析纯，购自北京化工厂有限责任公司;Caspase-9免疫组化链霉亲和素-生物素复合物（SABC)法检测试剂盒，武汉博士德生物有限公司产品；睾酮酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒，美国CSB公司产品；醋酸铀，上海瑞诚化工有限公司产品Epon812环氧树脂，沈阳市强华试剂厂产品。1.1.3主要仪器设备9905014型轮转式切片机，购自上海Leica仪器有限公司；BSllo型电子天平，德国Sartorius公司产品EG1150型包埋机，德国Leica公司产品；JEE-5B型真空冷冻干燥机，北京永光明医疗仪器厂产品；HITCHE-1010型离子溅射仪，日本日立公司产品；S-3400N型扫描电镜，日本日立公司产品；CX21型普通光学显微镜，日本Olympus公司产品。畜牧与饲料科学1.2订试验方法1.2.1亚慢性砷染毒大鼠模型的建立根据笔者所在课题组的前期研究并结合相关文献 10-,适应性饲养1周后,将大鼠随机分为4组，分别为对照组以及低、中、高剂量染毒组，每组10只。采用自由饮水方式进行染毒，低、中、高剂量染毒组染毒剂量分别为2.4、12、6 0 mg/L,连续染毒14周。对照组给予蒸馏水。每天观察大鼠的健康情况，每周测定并记录大鼠体重。1.2.2检测指标及方法1.2.2.1大鼠白细胞计数及血清TNF-a、I L-1浓度的检测试验结束时,用血常规管收集大鼠外周血,利用全自动动物血液分析仪进行白细胞计数；用采血EP管收集心脏血液,30 0 0 r/min离心8 min,取上清液，放入-2 0 冰箱待测，严格按ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，通过公式换算，得出TNF-及IL-1 的浓度值。1.2.2.2透射电镜观察附睾精子的超微结构观察指标：正常精子头部形态（顶体为双层膜性结构，双层顶体膜间为低电子密度，核染色质较均匀）；正常精子