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BCLAF1
调控
乳腺癌
死亡
敏感性
研究
网络出版时间:网络出版地址:调控乳腺癌铁死亡敏感性的研究王伟,朱涛摘要:目的探讨体外敲低 对乳腺癌细胞增殖和铁死亡的影响。方法应用 干扰乳腺癌细胞株 和 细胞中 的表达;采用 法鉴定干扰效果;运用 和 法检测各组细胞增殖活性;采用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;应用流式细胞术测定细胞的活性氧()水平;运用 和 法检测对铁死亡诱导剂 的敏感性。结果敲低组与对照组相比,在 和 细胞中稳转 后,的表达水平明显下降()。在 细胞中,第 天的 组吸光度()高于 组()和 组();在 细胞中,第 天的 组吸光度()高于 组()和 组()()。当在 细胞中设定 组细胞 比例为 ,则 组和 组的 比例分别为 和 ;在 细胞中设定 组细胞 比例为 ,则 组和 组的 比例分别为 和 ()。抑制 细胞 组、组和 组的 分别为 、和 ;抑制 细胞 组、组和 组的 分别为 、和 ()。结论沉默 的表达可抑制乳腺癌的增殖能力、增加乳腺癌细胞的 水平及提高乳腺癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性,的表达可能增加乳腺癌对铁死亡的抗性。关键词:乳腺肿瘤;增殖;铁死亡中图分类号:文献标志码:文章编号:():接受日期:基金项目:中央高校基本科研业务项目()作者单位:中国科学技术大学生命科学与医学部基础医学院,合肥 作者简介:王伟,男,硕士研究生。:朱涛,男,博士,教授,通讯作者。:据统计 年全球乳腺癌患者人数超过肺癌,每年约 万新发病例 。虽然放化疗、内分泌治疗和靶向治疗使患者的生存期大大提高,但随着肿瘤细胞对治疗的耐受,肿瘤的复发和转移依然常见。乳腺癌细胞能逃避治疗诱导的细胞死亡,是引起治疗失败的原因之一。铁死亡是新型的细胞死亡方式,在肿瘤发生和治疗中发挥重要作用 。最近研究表明,不同细胞死亡途径相互联系,一些分子可能参与铁死亡和其他类型细胞死亡之间的转化。文献报道 在凋亡中发挥作用 ,但其与铁死亡之间的关系尚未见报道。本文通过 干扰技术敲低乳腺癌细胞系 和 中 的表达,分析其对乳腺癌细胞增殖和铁死亡的影响,为乳腺癌的治疗提供潜在的生物学靶点。材料与方法 细胞系与主要试剂人乳腺癌细胞株 和 ,均购自 公司;人胚胎肾细胞系 购自 公司;内切酶和 内切酶,均购自 公司;抗体购自 公司;抗体购自 公司;活性氧()探针 购自 公司;购自陶术公司。真核表达载体构建使用 在线软件设计 的 ,引物序列:;引 物 序 列:。引物退火处理,用 和 内切酶酶切 载体,酶切后的载体与引物连接,再将连接产物转化到感受态细胞中,涂板后放到培养箱中培养,然后挑取单克隆,摇菌后抽取质粒,送公司进行序列鉴定。病毒的包装、稳转细胞系的构建及分组使用磷酸钙法在 细胞中包装病毒,用滤膜过滤培养基收取病毒液。将病毒液加入到细胞培养基中,临床与实验病理学杂志 ;()后换液,等细胞长满传代时加入 嘌呤霉素,连续筛选 周,收集细胞 法检测敲低效率。实验分组:对照组 组,敲低组 组和 组。法检测蛋白表达去培养基,冲洗 次,加入蛋白裂解液放置冰上裂解 ,用细胞刮刮下细胞,提取总蛋白。行 凝胶电泳法,再转移到 膜上。用 脱脂牛奶在室温下封闭 ,与一抗 孵育过夜,第二天将膜与稀释后的二抗在室温下孵育,洗涤后加入 检测试剂显影。和 实验检测 和 细胞增殖能力取对数期细胞,消化后离心,再用新鲜培养基重悬,取 细胞悬液用血球计数板进行计数。每孔 细胞悬液,按每孔 接种至 孔板,按每孔 接种至 孔板。共设置 个相同的 孔板,每个处理组设置 个复孔,持续检测 天。检测时弃去培养基,然后在每孔加入 用培养基稀释 倍的 或 ,培养箱中孵育 后,实验直接用酶标仪测定 的波长处吸光度值,实验则弃去溶液,每孔中加入 的 并避光轻摇 ,酶标仪测定 的波长处吸光度值。克隆形成实验检测 和 细胞克隆形成能力取对数期细胞,消化后离心,再用新鲜培养基重悬,取 细胞悬液用血球计数板计数,孔板每孔接种 个细胞,每个处理组做 个复孔。弃去培养基,冲洗次,加入 多聚甲醛固定 ,弃去用 清洗次,晾干后加入 结晶紫染色过夜,清洗后拍照。流式细胞术活性氧()测定取对数期细胞,消化后离心,离心后用 重悬清洗 次,离心。避光条件下将含有测定 的探针与无血清的培养基混匀,再加到细胞中重悬细胞,放到细胞培养箱孵育 ,期间每隔 上下颠倒混匀细胞悬液,后再离心弃上清,加入 重悬上流式细胞仪测定细胞 水平。对流式细胞术检测结果进行统计,分析比较各组竖线右侧细胞比例。和 法检测 和 细胞对铁死亡诱导剂 的敏感性取对数期细胞,消化后离心,再进行计数,和 按每孔 接种至 孔板,每孔 细胞悬液,后每孔补加 不同浓度的 。设置 个药物浓度,同时每个处理组设置 个复孔,处理 的浓度分别为 、,处理 浓度为 、。药物处理 后,用 和 法测定吸光度。统计学分析使用 软件对所有数据进行统计学分析。每组实验结果至少是次独立重复实验的平均值,每组数据均用珋 表示,多组间的差异使用 。以 为差异有统计学意义。结果 的干扰效率检测 采用 法检测稳转 和 细胞中 的干扰效率。对 蛋白灰度值进行归一化处理,在 细胞中,组、组和 组的 蛋白灰度比值为 。在 细胞中,组、组 和 组 的 蛋白灰度比值为 。本组结果显示:与 组相比,组和 组的 蛋白水平显著下调(,图 )。图 ()和 ()细胞中 的敲低效率检测 敲低 对 和 细胞增殖能力的影响使用稳转细胞系进行 和 实验,检测敲低 对 和 细胞增殖能力的影响。结果显示:在 细胞中,第 天时 组在 处吸光度为 ,而 组 和 组 吸 光 度 分 别 为 和 ;在 细胞中,第 天时 临床与实验病理学杂志 ;()组在 处吸光度为 ,而 组和 组吸光度分别为 和 。表明 与 组 相 比,组 和 组的细胞增殖能力显著下降(,图 )。图 敲低 对 ()和 ()细胞增殖能力的影响 敲低 对 和 细胞克隆形成能力的影响使用稳转细胞系进行克隆形成实验,检测敲低 对 和 细胞克隆形成能力的影响。结果显示:在 细胞中,与 组相比,组和 组的细胞克隆数比值分别为 和 ;在 细胞中,与 组相比,组和 组的细胞克隆数比值分别为 和 ;提示 组、组与 组相比,前两者的细胞克隆形成能力显著下降(,图 )。敲低 对 和 细胞产生 水平的影响使用稳转细胞系进行流式细图 敲低 对 ()和 ()细胞克隆形成能力的影响胞术实验,检测敲低 对 和 细胞产生 水平影响。结果显示:在 细胞中设定 组细胞 比例为 ,则 组和 组的 比例分别为 和 ;在 细胞中设定 组细胞 比例为 ,则 组和 组的 比例分别为 和 ;表 明 组、组 与 组相比,前两者的细胞产生更多的 (,图 )。敲低 后 和 细胞对铁死亡诱导剂 敏感性的影响使用稳转细胞临床与实验病理学杂志 ;()图 敲低 对 ()和 ()细胞产生 水平的影响系进行 和 实验,检测敲低 后 和 细胞对铁死亡诱导剂 敏感性的影响。结果显示:在 细胞中,组的 为 ,组 和 组的 分别为 、;在 细胞中,组的 为 ,组和 组的 分别为 、;提示敲低 蛋白后乳腺癌细胞对 更加敏感(,图 )。图 敲低 后 ()和 ()细胞对铁死亡诱导剂 敏感性的影响 讨论铁死亡作为新型的细胞死亡方式,成为许多疾病机制研究与干预的新靶点。铁死亡是铁依赖于 激活的脂质过氧化的程序性细胞死亡,脂质过氧化会导致细胞质膜的破裂,最终导致细胞死亡 。铁死亡与细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬等死亡形式不同,它主要表现为铁依赖的活性氧和脂质过氧化积累,谷胱甘肽()的耗竭和 的失活等 。蓝炜强等 发现铁死亡关键蛋白 高表达与结肠癌的发生、发展及不良预后密切相关,可作为结肠癌潜在的分子生物学标临床与实验病理学杂志 ;()志物以及预后评估指标。目前,铁死亡治疗方案还处于实验阶段。在乳腺癌模型的光热治疗过程中,纳米复合材料 可以促进 耗尽,从而导致 失活增强乳腺癌细胞铁死亡 。在 阳性乳腺癌中,阿霉素作为化疗药物和氯化铁作为铁死亡诱导剂的三联治疗比单药治疗更有效 。因此,靶向铁死亡治疗乳腺癌可能成为未来的新方向。最初被鉴定为与腺病毒 同源物 相互作用的结合蛋白,在多个肿瘤细胞系中 低表达,过表达 会导致 细胞的凋亡而被认为是肿瘤抑制因子 。研究表明,直接或间接的成为剪接体以及 复合体成分,参与 的剪接以及 出核等相关过程 。前期研究中过表达 蛋白可增加 细胞的凋亡,我们推测 蛋白高表达可能促进凋亡,而低表达则抑制凋亡。在乳腺癌细胞系中 蛋白高表达,其与不良预后有关 ,推测 可作为癌基因发挥作用,促进细胞增殖和抑制细胞死亡。蛋白可能并非通过凋亡而是其他细胞死亡方式导致的细胞存活;但对其他的细胞死亡方式是否有调控作用尚不清楚。查阅文献发现在肝癌细胞系 中敲低 蛋白后,影响的下游基因会富集在脂肪酸代谢、氧化磷酸化和 通路上 ,这些通路跟细胞铁死亡关系密切。有研究发现,在敲低 蛋白的肺癌细胞系 中,加入铁死亡诱导剂 后使细胞活力下降,而在加入 的同时还加入铁死亡保护剂 后,则使细胞活力上升 ;提示 蛋白可能参与铁死亡的调控,猜测 蛋白在乳腺癌中同样能调控铁死亡的发生。本实验在 和 细胞中用 敲低 ,显示细胞活力减弱,表明 的表达能够促进乳腺癌细胞增殖。敲低 后,细胞中产生更多的 ,表明 的表达能够降低脂质过氧化水平,且提高乳腺癌细胞对铁死亡诱导剂 的敏感性。总之,敲低 的表达后 和 细胞增殖能力下降,提示其对铁死亡更加敏感。综上所述,敲低 可增加乳腺癌细胞对铁死亡的敏感性,但具体分子机制还需进一步分析。参考文献:,:,():,:,():,():,:,():,:,():,():蓝炜强,陈光文,杨依昂,等结肠癌中铁死亡相关蛋白 的表达及其与预后的相关性 临床与实验病理学杂志,():,():,():,():,():,():,():,():,():临床与实验病理学杂志 ;(),():,(,),(),(),()()(),()()()(),(),(),:;简讯统计学符号书写要求统计学符号按 统计学名词及符号 的规定一律采用斜体排印。()样本的算术均数用英文小写珋,中位数用;()标准差用英文小写 ;()标准误用英文小写 珋;()检验用英文小写 ;()检验用英文大写 ;()卡方检验用希文小写;()相关系数用英文小写 ;()检验用英文小写 ;()概率用英文大写 (值前应给出具体检验值,如 值、值等);()比值比用英文大写 ;()可信区间用 表示。临床与实验病理学杂志 ;()