LLY-283在顺铂诱导的内耳毛细胞损伤中的保护作用研究.pdf

DOI:10.16605/ki.1007-7847.2023.03.0133LLY-283 在顺铂诱导的内耳毛细胞损伤中的保护作用研究张悦1,韩京宏2,聂国辉1*(1.南华大学衡阳医学院 深圳市第二人民医院研究生协作培养基地,中国湖南 衡阳 421001;2.深圳市第二人民医院,中国广东 深圳 518035)摘要:为了探究蛋白精氨酸甲基转移酶 5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)选择性抑制剂LLY-283对经顺铂诱导的内耳毛细胞损伤作用的影响,本研究首先建立顺铂诱导的 HEI-OC1 细胞损伤模型,确定合适损伤浓度后,设置对照组、顺铂损伤组及 LLY-283 预处理实验组(给予 40140 滋mol/L 梯度浓度的 LLY-283 预处理 2 h 后,再加入顺铂损伤 24 h),通过 CCK-8 实验检测各组细胞存活率,并采用流式细胞术观察凋亡情况。随后,建立新生鼠基底膜体外培养模型和斑马鱼模型,进一步验证 LLY-283 在顺铂诱导的毛细胞损伤中的保护作用。结果显示,与顺铂损伤组相比,LLY-283 可显著降低顺铂的细胞毒性,抑制顺铂诱导的 HEI-OC1 细胞凋亡,增加 HEI-OC1 细胞的存活率;同时,LLY-283 能够降低顺铂诱导的小鼠基底膜毛细胞死亡率,并减轻顺铂对斑马鱼侧线毛细胞的损伤作用。实验初步表明,LLY-283 可拮抗顺铂的毛细胞毒性并保护听觉毛细胞,有望成为防治顺铂诱发药物性耳聋的潜在药物。关键词:蛋白精氨酸甲基转移酶 5(PRMT5)抑制剂;LLY-283;顺铂;听觉毛细胞中图分类号:Q74,R764.43文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)04-0298-07收稿日期:2023-03-11;修回日期:2023-05-29;网络首发日期:2023-07-27基金项目:国家自然科学基金重大研究项目(82192865);国家自然科学基金面上项目(81970875);国家自然科学基金青年科学基金项目(82000982)作者简介:张悦(1995),女,黑龙江双鸭山人,硕士研究生;*通信作者:聂国辉(1963),男,湖南岳阳人,博士,教授,主要从事内耳毛细胞损伤与保护研究,E-mail:nieguohui_。LLY-283 Antagonizes Cisplatin-induced Damage to AuditoryHair CellsZHANG Yue1,HAN Jinghong2,NIE Guohui1*(1.Graduate Collaborative Training Base of Shenzhen Second People s Hospital,Hengyang Medical School,University of SouthChina,Hengyang 421001,Hunan,China;2.Shenzhen Second People s Hospital,Shenzhen 518035,Guangdong,China)Abstract:To investigate the effect of protein arginine methyltransferase 5(PRMT5)selective inhibitor LLY-283 on cisplatin-induced inner ear hair cell injury,a cisplatin-induced HEI-OC1 cell injury model wasfirst established.After the appropriate injury concentration was determined,the control group,cisplatin in-jury group and LLY-283 pretreatment group were set up.For the LLY-283 pretreatment group,the cells werepretreated with gradient concentrations of LLY-283(40140 滋mol/L)for 2 h,and then treated with cisplatinfor 24 h.The cell viability was detected by CCK-8 assay,and the apoptosis was observed by flow cytometry.Subsequently,an in vitro culture system of neonatal rat basement membrane was established and a zebrafishmodel was introduced to further verify the protective effect of LLY-283 on cisplatin-induced auditory haircell damage.The results showed that,compared with the cisplatin injury group,the LLY-283 pretreatmentgroup showed a significant reduction in cytotoxic effects of cisplatin,an increased survival rate of HEI-OC1cells,and significant inhibition of the apoptosis induced by cisplatin.At the same time,LLY-283 reducedcisplatin-induced mortality of hair cells in the basement membrane of mice and also reduced cisplatin-in-duced damage to zebrafish lateral line hair cells.The preliminary experiments revealed that LLY-283 could第 27 卷 第 4 期生命科学研究灾燥造援27 晕燥援4圆园23 年 8 月蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡Aug.圆园23窑 细胞与生理学 窑第 4 期张悦等：LLY-283 在顺铂诱导的内耳毛细胞损伤中的保护作用研究顺铂是临床治疗中的常见化疗药物,对肿瘤患者具有良好的治疗效果1,但同时也有着不可忽视的副作用2。其中,顺铂引起的听力损失近年来受到广泛关注3-4。目前,美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)和中国国家药品监督管理局尚未批准任何治疗药物或方法来预防及治疗化疗药物引起的听力损失。因此,针对顺铂致药物性耳聋的机制研究和内耳保护药物的探索具有重要的临床意义。现代药理学研究表明,表观遗传调控与内耳发育密切相关5-6。表观遗传调控是指治疗药物通过染色质结构的翻译后修饰来调节基因表达,而不涉及 DNA 序列的改变。其中,蛋白质的精氨酸甲基化是一类重要的翻译后修饰,通过调节转录和转录后 RNA 加工,在细胞生长、增殖、凋亡及血管生成等关键阶段发挥着不可或缺的作用7。这种修饰是由蛋白精氨酸甲基转移酶(protein argi-nine methyltransferase,PRMT)家族催化的,PRMT家族的异常表达会导致多种疾病8。迄今为止,研究人员已经鉴定出 9 种人类 PRMT,根据精氨酸甲基化催化的类型,其可进一步细分为玉型、域型、芋型和郁型。PRMT5 是主要的域型 PRMT,作为关键酶参与基因转录调控和信号转导、DNA 损伤后修复和细胞增殖等生物学过程9。同时,PRMT5在体内明显催化多种组蛋白和非组蛋白底物的对称甲基化,并在调节多个细胞过程中发挥重要作用,包括转录、RNA 代谢、信号转导、高尔基体体系结构的维护和细胞分化9-10。在细胞核中,PRMT5还可以与 SWI/SNF(switch/sucrose non-fermenta-ble)相互作用,催化组蛋白 H2A 精氨酸 3(H2AR-3me2s)、H3 精氨酸 8(H3R8me2s)和 H4 精氨酸 3(H4R3me2s)底物的对称二甲基化,抑制下游周期调控因子和肿瘤抑制基因的转录11-12。目前,选择性 PRMT5 抑制剂 LLY-283 已被发现可降低头颈部鳞状细胞癌、裸鼠皮下移植瘤的形成或增殖能力13。同时也有团队发现,LLY-283 可能通过抑制活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累,激活 PI3K/Akt 信号通路,来发挥对噪声性听力损失小鼠的治疗作用14。而且,已有研究初步表明,LLY-283 可抑制顺铂诱导的 PRMT5表达升高,并在化疗药物造成的听觉细胞损伤中具有保护作用15。不过,现阶段在体证明 LLY-283对内耳毛细胞具有保护作用的证据仍然不足。基于此,本文主要利用多种体外模型深入探讨LLY-283 在顺铂诱导的内耳毛细胞损伤中的潜在作用,为该药物及其他选择性 PRMT5 抑制剂的开发提供参考。1材料与方法1.1材料实验使用的 HEI-OC1 细胞由上海复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟教授团队赠送,野生型 C57BL/6j 新生鼠购自珠海百试通生物科技有限公司。所有操作均按照深圳市第二人民医院动物保护与利用机构委员会的指导方针进行。实验使用的 Tg(brn3c:mGFP)s356t 转基因斑马鱼毛细胞带有绿色荧光。根据标准饲养方法(参照 TheZebrafish Book,http:/www.zfin.org),斑马鱼置于净水系统中养殖,系统水温及环境温度恒定为(28依0.5)益,水质酸碱度控制在 7.47.5,设定 14 h/10 h光暗循环,通过自然配对受精得到斑马鱼胚胎。胚胎年龄用受精后天数(days post-fertilization,dpf)标记。实验使用的试剂主要包括:LLY-283(纯度99.12%)、顺铂(纯度 99.84%)(Selleck 公司,美国);10%驴血清、高糖 DMEM 培养基(Hyclone 公司,美国);胎牛血清(Gibco 公司,美国);CCK-8 试剂(Do-jindo 公司,日本);Annexin-V/PI 647 试剂盒(四正柏生物科技有限公司);DMEM/F12 培养基、N2 添加剂、B27 添加剂(Thermo Fisher 公司,美国);Cell-Tak 细胞组织粘合剂(Corning 公司,美国);rabbitanti-myosin 7a 一抗(Proteus Biosciences 公司,美国);4忆,6-二脒基-2-苯基吲哚(4忆,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)荧光染料、488 donkey anti-rab-bit 二抗、anti-green fluorescent protein 一抗(Invitro-gen 公司,美国)。1.2HEI-OC1 细胞培养及最佳顺铂损伤浓度确立HEI-OC1 细胞培养于 33 益含有 10%CO2的antagonize the toxicity of cisplatin and protect auditory hair cells,indicating that the PRMT5 inhibitor maybe a potential drug for the prevention and treatment of cisplatin-induced hearing loss.Key words:protein arginine methyltransferase 5(PRMT5)inhibitor;LLY