LncRNA SLC16A1-AS1靶向调控miR-182对乳腺癌BT549细胞增殖能力的影响.pdf

网络出版时间：网络出版地址：论著 靶向调控 对乳腺癌 细胞增殖能力的影响蒋冰，马琳，刘骞摘要：目的探讨 对 的靶向调控作用及对乳腺癌 细胞增殖能力的影响。方法使用 工具分析 数据库中 在三阴型乳腺癌（，）中的差异性表达，应用 数据库进行生存分析。利用 和 数据库预测 的潜在靶标 。用 检测 在 组织及细胞系（、及 ）中的表达。利用双荧光素酶活性测定及 免疫沉淀实验验证 与 的结合力。用 及集落形成实验检测不同处理组 细胞增殖能力的变化。结果生物信息学分析结果显示，组织中 的表达水平显著低于正常组织（），与预后良好相关（），与 之间存在结合位点。在 例 组织中的表达水平显著低于瘤旁组织（，），在 细胞系中的表达水平亦显著低于正常乳腺上皮细胞系（）。在 细胞中过表达 可显著降低 载体的荧光酶素活性，免疫沉淀实验显示，同时富集 及 （）。与对照组相比，过表达 显著降低 细胞的增殖活性并减少集落形成数量，共表达 与 可恢复 细胞的增殖能力（）。结论 在 中低表达，且通过靶向调控 在体外抑制 细胞的增殖能力，轴有望成为 治疗的潜在靶点。关键词：乳腺肿瘤；三阴型乳腺癌；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：接受日期：作者单位：辽宁省肿瘤医院病理科，沈阳 作者简介：蒋冰，女，博士，副主任医师。：乳腺癌是全球女性常见的恶性肿瘤 ，位居癌症相关死亡原因的第二位 。随着乳腺癌筛查项目的普及和新型联合抗癌疗法的进展，发现其发病率和病死率已呈显著下降趋势 。然而，中国等发展中国家的乳腺癌筛查率仍较低，其预后较差 。乳腺癌是一组异质性较强的肿瘤，不同分子分型的乳腺癌具有不同的发病机制及预后，对应的辅助及新辅助治疗方案也不同 。三阴型乳腺癌（，）因 、均阴性 ，不能从内分泌治疗及 靶向治疗中获益 。近年，文献报道许多分子参与了 的发生、发展，明确其分子特征及发挥作用的机制，将有助于 的诊断及治疗 。研究发现，能够调节肿瘤相关基因的表达并参与肿瘤发生、发展的生物学过程，包括增殖、侵袭、细胞周期进程、凋亡、分化及免疫反应等 。最近一项研究表明，在非小细胞肺癌中表达下调，可作为预后良好的预测因子 。目前，有关 的报道非常有限，国内尚未见其在 中 的 研 究。本 文 旨 在 探 讨 对 细胞增殖能力的影响及可能的靶向调控因子，为 的治疗提供理论参考。材料与方法 在线数据收集及生物信息学分析使用 （：）数据库分析 数据，预测 在 中的差异性表达。（：）数据库分析 与 预后的关系，纳入总生存期患者 例。使用 和 数据库预测 的潜在靶标 。使用 （：）预 测 可能形成的互补碱基对。组织学标本收集我院存档的 组织学标本 例（配对的肿瘤及瘤旁新鲜组织），保存于临床与实验病理学杂志 ；（）冰箱，用于检测 表达。细胞培养 细胞系 、和 正 常 乳 腺 上 皮 细 胞 系 ，均购自美国 公司。细胞专用培养基、含 的 培养基及含 的 培养基，均购自美国 公司。常规细胞在 、湿度及 的培养箱中培养，通常在培养皿内细胞密度约 时收集用于后续实验。细胞转染以 载体为骨架构建 质粒（公司）；合成 阴性对照物及 （公司）；应用 进行转染。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。分组：组（转染 阴性对照物），组（转染 空白载体），组（细胞未转染），挽救实验阴性对照组（共转染 阴性对照物及 空白载体）。转染后 收集细胞，检测转染效率，进行后续实验。提取及 使用 （美国 公司）提取总 ；应用 （德国 公司）行 ，检测 的表达，以 作为内部对照。使用 （美国 公司）行 ，检测 的表达，以 作为内部对照。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。通过 法计算相对 丰度，引物序列详见表 。反转录体系：，上游引物 ，下游引物 ，及 。反应条件：，合计 个循环。表 引物序列基因名称上游引物（）下游引物（）双荧光素酶活性实验构建荧光素酶报告基因野生型质粒 及突变型质粒 （美国 公司）。用 （美国 公司）将上述荧光素酶报告基因质粒、共转染至 细胞系中，进行荧光素酶活性测定（美国 公司）。免疫沉淀（，）实验使用 （美国 公司）验证 和 的结合力。用于 测定的抗体包括抗 和对照 ，共沉淀的 用于 合成，并通过 进行评估。检测使用胰蛋白酶消化细胞，收集并进行细胞计数。将细胞密度调整至每毫升 个细胞，在 孔细胞培养板中每孔加入培养基 （个复孔），用铝箔纸包裹，在、的培养箱中培养。实验分别于 、及 取出培养板，加入 （日本 公司）溶液，后用酶标仪测定 值。集落形成实验孔板内分组处理细胞，培养 后将细胞种植到 个最大径 的细胞培养皿中（每培养皿 个细胞），孵育 天。用磷酸盐缓冲液洗涤，结晶紫染色，计数超过 个细胞的集落数。通过显微镜手动计数菌落数量。统计学分析采用 及 软件进行数据分析，每项实验均至少重复次。非配对 检验用于比较两个独立组别的荧光素酶活性及 。以 为差异有统计学意义。结果 组织中 的表达使用 工具分析 数据发现，在 组织中的表达水平显著低于非肿瘤组织（，图 ）。数 据 库 分 析 结 果 显 示：与 患者总生存期相关，低表达者预后不良（，图 ）。例 组织学标本中，在肿瘤组织中的表达显著低于瘤旁组织（，图 ）。乳腺癌细胞中 的表达使用 检测 在 细胞系 、及 中的表达，结果显示：与正常乳腺上皮细胞临床与实验病理学杂志 ；（）图 三阴型乳腺癌组织中 的表达及其与预后的关系：生物信息学分析 在三阴型乳腺癌组织中的表达；表达与患者总生存期的关系；例三阴型乳腺癌组织学标本中 的表达；相比，细胞系中 表达均显著下调（，图 ）。将 质粒转染至 细胞中，可显著上调其表达（，图 ）。图 三阴型乳腺癌细胞中 的表达水平：在多种乳腺细胞系中的表达；将 质粒转染至 细胞中的表达；过表达 对 细胞增殖能力的影响 实验结果显示：与 组相比，过表达 后细胞增殖活性显著降低（，图 ）。集落形成实验结果显示：与 组相比，过表达 后细胞形成的集落数量显著减少（，图 ）。图 过表达 对 细胞增殖的影响：实验；集落形成实验；临床与实验病理学杂志 ；（）与 靶向调控的关系首先，通过 和 数据库预测 的潜在靶标 ，选择排名靠前的 进行评估。使用 （：）预测两者之间的结合位点（图 ）。双荧光素酶活性实验结果显示，在共转染 与 的 细 胞 中，可 以 显 著 降 低 的荧光素酶活性，但不能降低 的荧光素酶活性（，图 ）。实验显示，抗体可以同时富集 和 （，图 ）。图 对 靶向调控关系的验证：生物信息学预测 与 之间的互补位点；双荧光素酶活性实验；实验；过表达 逆转 对乳腺癌 细胞增殖的抑制作用挽救实验中，将 转染至 细胞中，可显著上调其表达水平（，图 ）。实验结果显示，与阴性对照组相比，过表达 组细胞增殖活性显著增高，共表达 和 ，后者可恢复 细胞的增殖活性（，图 ）；集落形成实验结果显示，与阴性对照组相比，过表达 组细胞集落形成数量显著增加，共表达 和 ，后者可恢复 细胞形成集落的能力（，图 ）。图 挽救实验：上调 在 细胞中的表达；实验；集落形成实验；临床与实验病理学杂志 ；（）讨论乳腺癌异质性极强，不同分子分型的乳腺癌治疗方案不同。由于 、均阴性，不能受益于内分泌治疗及 靶向治疗，临床治疗效果不佳。全面了解 进展的分子机制并确定新的预后预测因子具有重要意义。是非编码 家族的重要成员，具有 多个核苷酸的转录本，曾被称为遗传的“噪音”。最近，在多种癌症中的异常表达已有报道，且 已被证明在肿瘤进展中发挥重要作用 ，。越来越多的研究集中在 的功能和调控上，以发现癌症诊断和治疗的新靶点。本实验首先通过分析 数据库确定 在 组织中表达显著下调，且与良好预后相关；其次在 例 组织学标本中进一步验证 在肿瘤组织中表达显著降低；通过 实验及集落形成实验证实，过表达 可以在体外抑制 细胞增殖。目前，有关 调控肿瘤相关机制的研究非常有限。等 发现 在非小细胞肺癌中表达明显下调，过表达 可以抑制肺癌细胞的活性和增殖、阻断细胞周期进程及促进细胞凋亡，并推测其有可能通过 通路发挥上述肿瘤调控作用，高表达可能是非小细胞肺癌预后良好的潜在预测因子。等 发现 在口腔鳞状细胞癌中表达上调，下调其表达可显著抑制癌细胞增殖、诱导细胞周期 停滞，被认为可能作为口腔鳞状细胞癌新的诊断指标及治疗靶点。最近一项研究 证实，可以靶向结合 共同激活、诱导促进膀胱癌进展的代谢重编程过程，从而增强膀胱癌细胞的侵袭能力。等 报道 靶向 促进胶质母细胞瘤增殖。还可通过靶向调节 细胞因子信号抑制蛋白 轴抑制子宫颈癌细胞增殖 。此外，在肝细胞癌中表达显著上调，是潜在的预后不良因子，并通过促进 甲基化促进肝细胞癌增殖 。目前，国内有关 在乳腺癌中调控机制的研究尚未见报道。年 等 提出竞争性内源 （，）假说，他们推测 ，尤其是 可以部分互补性竞争 结合位点，并将这些 命名为 ，这种相互作用机制导致 水平降低或 活性受损。随着 假说的提出，靶向作用轴逐步成为很多非编码 研究的热点理论基础。本实验通过生物信息学预测 是 潜在作用靶点，两者之间存在多个互补的碱基对，通过双荧光素酶活性检测及 实验验证两者的结合力；通过 及集落形成挽救实验，在共转染 和 的 细胞中，可以逆转 对 细胞增殖的抑制作用，进一步验证 靶向调控 抑制 细胞增殖。综上所述，在 中异常低表达，与良好预后相关，过表达 能够显著抑制乳腺癌细胞 的增殖能力；作为内源性因子靶向调控 ，继而抑制 恶性进程。总之，本研究为进一步分析 发生、发展的机制及治疗靶标提供参考。参考文献：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：（），（）：，（），（）：，：临床与实验病理学杂志 ；（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：？，（）：，（，）（）（，）（），（）（，），（），（），（）：；临床与实验病理学杂志 ；（）