2016—2020年安徽省手足口病相关柯萨奇病毒A组16型分子分型研究.pdf

热带病与寄生虫学2023年8月第21卷第4期J Trop Dis Parasitol,Aug.2023,Vol.21,No.4手足口病防控专题20162020年安徽省手足口病相关柯萨奇病毒A组16型分子分型研究冯明子1，傅荔艳1，葛盈露2，马婉婉2，王鹏2，孙永2，史永林1,21.安徽医科大学公共卫生学院，安徽 合肥 230032；2.安徽省疾病预防控制中心，安徽省公共卫生研究院，安徽省医疗卫生重点专科病原微生物分子生物学实验室摘要：目的了解安徽省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）相关柯萨奇病毒A组16型（coxsackievi-rus A16,CV-A16）基因型别分布情况。方法通过中国疾病预防控制信息系统传染病报告管理信息系统收集安徽省20162020年HFMD病例资料，并收集HFMD患儿咽拭子标本。对荧光定量PCR检出的CV-A16核酸阳性病例样本采用RT-PCR扩增VP1区基因片段并测序。运用肠道病毒在线分型工具确定基因型别，再利用MEGA6.0生物软件构建CV-A16 VP1区基因进化树并分析VP1区氨基酸变异位点。结果20162020年安徽省累计报告HFMD实验室确诊病例16 650例，其中CV-A16确诊病例3 809例（占22.88%），各年中CV-A16确诊病例占比依次为20.72%（219/1 057）、22.91%（677/2 955）、23.89%（1 004/4 202）、42.58%（1 687/3 962）、4.96%（222/4 474）。对获取的436份CV-A16阳性标本进行测序，获得290条VP1区基因序列，均属于B基因型，其中B1a基因亚型 65条，B1b 225条。290条VP1区基因序列核苷酸同源性为86.80%100.00%，与CV-A16原型株G-10核苷酸同源性为74.10%76.80%。65条B1a毒株VP1区基因序列与B1a参考株核苷酸同源性为93.00%99.90%，225条B1b毒株VP1区基因序列与B1b参考株核苷酸同源性为88.40%99.60%。B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇，B1b基因亚型流行株在遗传进化上分为6个分支簇。与原型株G-10 VP1区编码氨基酸位点变异分析显示，290条VP1区基因存在多个位点变异。结论20162020年安徽省HFMD CV-A16流行株B1a与B1b基因亚型二者共同流行，应持续关注安徽省肠道病毒病原监测与分子进化变异情况。关键词：手足口病；柯萨奇病毒A组16型；分子分型；安徽省中图分类号：R373.2文献标识码：A文章编号：1672-2302（2023）04-0199-05DOI：10.3969/j.issn.1672-2302.2023.04.005Molecular typing of coxsackievirusA16 associated hand,foot and mouthdisease inAnhui Province,2016-2020FENG Mingzi1,FU Liyan1,GE Yinglu2,MAWanwan2,WANG Peng2,SUN Yong2,SHI Yonglin1,21.School of Public Health,Anhui Medical University,Hefei 230032,Anhui Province,China;2.Anhui Provincial Centerfor Disease Control and Prevention;Public Health Research Institute of Anhui Province;Key Laboratory for Medicaland Health Science of Anhui ProvinceCorresponding author:SHI Yonglin,E-mail:Abstract：ObjectiveTo understand the genetic types of coxsackievirus A16(CV-A16)associated with hand,foot andmouth disease(HFMD)in Anhui Province.MethodsThe case data on HFMD reported in Anhui Province from 2016to 2020 were downloaded from the Infectious Disease Reporting and Management System under the China Disease Pre-vention and Control Information System,and the throat swab samples were collected from HFMD children during thecorresponding period.The samples of positive CV-A16 nucleic acid detected by real-time PCR were selected,and ampli-fied for VP1 gene using reverse transcription PCR.Then the positive PCR products were sequenced.Software Molecu-lar Evolutionary Genetics Analysis(MEGA,version 6.0)was used to construct the phylogenetic tree and for analysis ofthe mutation at amino acid of VP1 gene.ResultsIn total,16 650 cases of HFMD confirmed by laboratory studieswere reported in Anhui Province from 2016 to 2020,including 3 809 cases of CV-A16 types(22.88%).The annual con-stituent ratio of CV-A16 was 20.72%(219/1 057),22.91%(677/2 955),23.89%(1 004/4 202),42.58%(1 687/3 962)and 4.96%(222/4 474),respectively in different years.290 VP1 sequences were obtained from 436 CV-A16 positive基金项目：安徽省自然科学基金项目（1708085QH186）作者简介：冯明子，女，硕士在读，研究方向：公共卫生检验与检疫。E-mail:通信作者：史永林，E-mail: 199热带病与寄生虫学2023年8月第21卷第4期J Trop Dis Parasitol,Aug.2023,Vol.21,No.4specimens,all of which belonged to B genotype,including 225 from B1b and 65 from B1a.The nucleotide homology of290 VP1 sequences was in between 86.80%and 100.00%,and that of G-10 VP1 sequence was in between 74.10%and76.80%.The nucleotide homology between 65 strains VP1 of B1a and reference strains identified as genotype B1a inGenBank database was 93.00%-99.90%.The nucleotide homology between the VP1 sequence of 225 B1b strains and thereference strains identified as genotype B1b in GenBank database was 88.40%-99.60%.The B1a and B1b genotypesconsisted of 4 sub-clusters and 6 sub-clusters in genetic evolution.Amino acid variation analysis of the prototype strainG-10 revealed mutations at many sites of CV-A16.ConclusionB1a and B1b gene subtypes of HFMD CV-A16strains were co-prevalent in Anhui Province during 2016-2020.It is necessary to continually monitor the molecular evo-lution of enterovirus pathogens in Anhui Province.Keywords：Hand,foot and mouth disease;CV-A16;Molecular typing;Anhui Province柯 萨 奇 病 毒 A 组 16 型（coxsackievirus A16,CV-A16）是小RNA病毒科肠道病毒属的一种，为单正链RNA病毒，基因组全长约7.4 kb，是引发手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）的常见病原体之一，于 1951 年首次被分离出1。按照CV-A16 基因组 VP1 区基因序列可将其分为 A、B和D三个基因型，A基因型的唯一成员是G-10原型株；而B基因型分为B1、B2亚型，B1亚型进一步分为 B1a、B1b 和 B1c；D 基因型为新发现型别，比较少见2-3。近年来安徽省HFMD发病水平一直较高，而对HFMD相关病原学的分子分型研究相对较少4-5。本研究收集安徽省各地的HFMD CV-A16核酸阳性咽拭子标本，利用生物信息学和分子遗传学方法鉴定病毒基因型，并对其VP1区测定的序列进行遗传进化和氨基酸变异位点分析，为进一步研究疾病分子机制提供参考依据。1材料与方法1.1资料与标本来源本研究中安徽省2016年1月2020年12月HFMD病例信息来源于中国疾病预防控制信息系统传染病报告管理信息系统。收集安徽省各市（县、区）2016年1月2020年12月HFMD患者CV-A16核酸阳性咽拭子样本。病例标本采集与实验室检测符合 手足口病预防控制指南（2009版）6要求。1.2主要试剂与仪器核酸提取试剂盒（665A，中国台湾圆点公司）；磁珠法自动核酸提取仪（SLA-32，中国台湾圆点公司）；荧光定量PCR扩增仪（Quant-Studio 5,Thermo Fisher）；普通PCR扩增仪（Master-cycler X50P,Eppendorf）；肠道病毒CV-A16荧光定量PCR检测试剂盒（P531，西安天隆公司）；PrimeScriptOne Step RT-PCR Kit Ver 2.0（RR055A,Takara）。1.3核酸抽提与荧光定量PCR 和RT-PCR取出保存的咽拭子标本在室温条件下融化，漩涡振荡混匀后在二级生物安全柜内取200 L混匀液抽提病毒RNA，提取步骤按照核酸提取仪操作说明书进行，程序运行完成后吸取核酸洗脱液置-20备用。采用肠道病毒CV-A16荧光定量PCR检测试剂盒对收集到的HFMD核酸阳性标本进行检测，对检出的 CV-A16 阳性标本 VP1