HSA_g-C_%283%29N_%284%29作为电致化学发光探针检测β-淀粉样蛋白.pdf

第4 4卷 第4期2 0 2 3年8月 青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)J o u r n a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.4 4 N o.4A u g.2 0 2 3 文章编号:1 6 7 2-6 9 8 7(2 0 2 3)0 4-0 0 3 4-0 7;D O I:1 0.1 6 3 5 1/j.1 6 7 2-6 9 8 7.2 0 2 3.0 4.0 0 4H S A/g-C3N4作为电致化学发光探针检测-淀粉样蛋白陈孜璇,李 文,杨晓燕*(青岛科技大学 化学与分子工程学院,山东 青岛 2 6 6 0 4 2)摘 要:采用一步煅烧法制备了一种电致化学发光(E C L)性能良好的类石墨相-碳化氮二维纳米材料(g-C3N4),经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化后,g-C3N4与人血清白蛋白(H S A)复合,得到H S A/g-C3N4复合材料。利用A与H S A的结合作用,将H S A/g-C3N4与不同浓度的-淀粉样蛋白(A)孵育,形成A/H S A/g-C3N4。同时将巯基修饰的A适体固定在金电极表面,通过适体与靶标的特异性结合,可以将A/H S A/g-C3N4捕获到电极上。在共反应剂K2S2O8存在下,该传感器实现了对A的E C L灵敏检测。研究表明,在1 0 f m o lL-1到1 0 0 n m o lL-1范围内,E C L强度与A浓度具有良好线性关系,检出限低至7.2 f m o lL-1。并且该传感器具有较高的灵敏度和较好的特异性。关键词:电致化学发光;类石墨相-碳化氮;人血清白蛋白;-淀粉样蛋白中图分类号:O 6 5 7.1 5 文献标志码:A引用格式:陈孜璇,李文,杨晓燕.H S A/g-C3N4作为电致化学发光探针检测-淀粉样蛋白J.青岛科技大学学报(自然科学版),2 0 2 3,4 4(4):3 4-4 0.CHE N Z i x u a n,L I W e n,YANG X i a o y a n.H S A/g-C3N4 a s a n e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n t p r o b e f o r t h e d e t e c t i o n o f-a m y l o i dJ.J o u r n a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n),2 0 2 3,4 4(4):3 4-4 0.收稿日期:2 0 2 2-0 8-0 3基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2 0 1 9 0M 0 5 1).作者简介:陈孜璇(1 9 9 7),女,硕士研究生.*通信联系人.H S A/g-C3N4 a s a n E l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n t P r o b e f o r t h e D e t e c t i o n o f-A m y l o i dC H E N Z i x u a n,L I W e n,Y A N G X i a o y a n(C o l l e g e o f C h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r E n g i n e e r i n g,Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,Q i n g d a o 2 6 6 0 4 2,C h i n a)A b s t r a c t:I n t h i s w o r k,t w o-d i m e n s i o n a l g r a p h i t e-l i k e c a r b o n n i t r i d e(g-C3N4),a s a n e f f e c-t i v e e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e(E C L)s u b s t r a t e,w a s p r e p a r e d b y o n e s t e p c a l c i n a t i o n m e t h-o d.A n d h u m a n s e r u m a l b u m i n(H S A)c o u l d b i n d t o g-C3N4 t o f o r m H S A/g-C3N4 c o m p l e-x e s a f t e r g-C3N4 w a s a c t i v a t e d b y u s i n g 1-e t h y l-3-(3-(d i m e t h y l a m i n o)p r o p y l)c a r b o d i i m i d e h y d r o c h l o r i d e a n d N-h y d r o x y s u c c i n i m i d e.A f t e r i n c u b a t i n g w i t h a m y l o i d-(A),A w a s b o u n d w i t h H S A t o f o r m A/H S A/g-C3N4 c o m p l e x e s v i a H S A-A i n t e r a c t i o n.S u b s e q u e n t-l y,t h e t h i o l-f u n c t i o n a l i z e d D NA a p t a m e r,a s t h e s p e c i f i c r e c o g n i t i o n e l e m e n t f o r A p e p t i d e,w a s a s s e m b l e d o n t h e g o l d e l e c t r o d e v i a A u-S i n t e r a c t i o n.T h e f o r m i n g A/H S A/g-C3N4 c o m p l e x e s w e r e t h e n a n c h o r e d o n t h e e l e c t r o d e t h r o u g h t h e s p e c i f i c r e c o g n i t i o n b e t w e e n t h e 第4期 陈孜璇等:H S A/g-C3N4作为电致化学发光探针检测-淀粉样蛋白t a r g e t A a n d t h e a p t a m e r.U n d e r t h e o p t i m i z e d c o n d i t i o n s,t h e p r e s e n t E C L s e n s o r r e v e a l s a g o o d l i n e a r r e s p o n s e t o A p e p t i d e r a n g i n g f r o m 1 0 f m o lL-1 t o 1 0 0 n m o lL-1 w i t h a d e-t e c t i o n l i m i t o f 7.2 f m o lL-1.T h i s b i o s e n s o r a l s o s h o w s g o o d s e n s i t i v i t y a n d s e l e c t i v i t y.K e y w o r d s:e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n t;g r a p h i t e-l i k e c a r b o n n i t r i d e;h u m a n s e r u m a l b u m i n;a m y l o i d-淀粉样蛋白(A)是由淀粉样前体蛋白(A P P)经-分泌酶和-分泌酶水解而来的含有3 94 3个氨基酸的多肽。它可由多种细胞产生,循环于血液、脑脊液和脑间质液中,大多与伴侣蛋白分子结合,少数以游离状态存在。A的神经毒性作用在阿尔茨海默病(A D)的病程进展中发挥着主要作用。动物实验显示,A对神经元的作用与其状态有关。溶解状态的A短时间内可促使神经突生长,提高神经元的存活率,而沉积状态的A对神经元呈现相反的作用,引起与A D相似的病理变化 神经突退缩和神经元变性,最显著地改变发生在衰老的哺乳类动物大脑1。A是由A P P中4 3个残基裂解而来的没有稳定结构的无序肽。虽然淀粉蛋白没有稳定结构,但是它们会经历构象波动,这可能导致其折叠或部分折叠状态。有些外部因素也可能阻碍蛋白质折叠,例如温度、p H、肽的浓度、与其他分子的相互作用、基因突变等。目前,有多种方法对A进行检测,例如荧光分析法2、比色法3、酶联免疫分析法4、电化学发光分析法5等。人血清白蛋白(H S A)是人血浆中的蛋白质。其非糖基化的单链多肽包含5 8 5个氨基酸,相对分子质量为6 6 k D。在血浆中其浓度为4 2 gL-1,约占血浆总蛋白的6 0%。在体液中H S A可以运输胆色素、脂肪酸、类固醇激素、氨基酸、金属离子和许多治疗分子等,同时维持血液正常的渗透压。金属离子和蛋白质对A聚集的调节对于解释阿尔茨海默病(A D)的病理学至关重要。人血清白蛋白(H S A)是金属和蛋白质运输的调节剂,可以调节体液中金属与A的相互作用和A的聚集。锌离子、铜离子、A和H S A之间的分子水平络合,能够改变A的聚集和细胞毒性,并诱导其细胞运输。因此,H S A能够控制非金属和金属结合的A聚集,并通过A-H S A络合帮助细胞运输A。人体内大多数有核细胞都有A的分泌,H S A是最丰富的血浆蛋白约 0.40.6 mm o lL-1,预计 9 0%的A将与人血浆中的H S A进行结合6-7。由于A和 H S A 之间的直接相互作用,H S A 被认为是一种可能抑制A在人体内聚集并降低 A D 发病和进展风险的关键蛋白8-9。H S A 不仅将大多数血浆 A 从易于聚集的状态中隔离出来,也有助于通过平衡转移将A从人脑脊液(C F S)运输到血浆。A-H S A 复合物的浓度随着A D进展而降低,这表明由H S A介导的A平衡转移在 A D 患者的大脑中发生异常1 0。因此,H S A 有望通过直接相互作用潜在地延迟C S F中的A聚集。据报道,A 单体和聚集体都直接与 H S A 相互作用9。在本工作中,设计了一个以g-C3N4为信号分子,通过H S A与A的相互作用,来实现信号响应的E C L生物传感器。g-C3N4具有稳定的E C L信号,H S A上游离的氨基与g-C3N4上的羧基形成酰胺键,以实现两者的结合,而A与H S A的作用使其结合到一起。由于D NA适配体(a p t a m e r)具有体积小、化学合成简便、稳定性高、免疫原性低等优点1 1,所以在本工作中利用D NA适配体与A的特异性识别,从而实现A的定量检测。1 实验部分1.1 试剂与仪器尿素、牛血清白蛋白、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、人血清白蛋白、六氟异丙醇等。A4 0:D A E F