EphB2调控claudin-6对子宫内膜癌侵袭和转移的影响.pdf

，（，）（，），：；网络出版时间：网络出版地址：调控 对子宫内膜癌侵袭和转移的影响孙帅，夏青，李凡，闵锐，韩悦心，冯振中，李楠，摘要：目的探讨 和 的靶向关系，观察敲低和过表达 基因通过调控 对子宫内膜癌细胞生长、迁移及侵袭的影响。方法采用 数据库分析 在子宫内膜癌和癌旁组织中的差异表达及其与临床病理特征的关系；应用 法预测 可能相关的功能通路；应用 数据库分析 互作基因；利用体外培养子宫内膜癌细胞；采用脂质体转染法转染子宫内膜癌细胞敲低和过表达 基因；采用 法和 法检测敲低和过表达 各组细胞 和 表达水平；提取转染后细胞进行细胞增殖、迁移和侵袭实验；免疫组化检测 和 蛋白在子宫内膜样癌中的表达。结果 数据库分析 例患者显示 在子宫内膜癌中高表达，可能是 最具相关性基因（）；数据库分析显示 表达可能与细胞黏附和细胞连接通路相关。法显示干扰后 表达：阴性对照组：、组：。划痕实验法检测不同分组中癌细胞的迁移能力，干扰后划痕愈合率显示：阴性对照组：、空白对照组：、组：；过表达后划痕愈合率显示：空白对照组：、空载体组：、过表达组：；敲低 后 表达显著下降，细胞增殖活力明显降低，细胞侵袭能力亦受到明显抑制，差异有统计学意义（均 ）；过表达 后 表达明显上升，细胞迁移和侵袭能力亦明显增强，差异有统计学意义（均 ）。实验显示：和 在子宫内膜样癌（例）和癌旁组织（例）中的表达，差异有统计学意义（）。结论 在子宫内膜癌中高表达，基因敲低和过表达影响子宫内膜癌细胞的生长及恶性生物学行为，其机制可能与调控 表达水平有关。关键词：子宫肿瘤；子宫内膜癌；生物学行为中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：子宫内膜癌（）是严重危害女性生 命 健 康 的 疾 病，研 究 显 示 年 全 球 约 例新发子宫内膜癌患者，子宫内膜癌相关死接受日期：基金项目：安徽高校自然科学研究项目（）、蚌埠医学院研究生科研创新计划资助（）、蚌埠医学院科技项目（）作者单位：蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠 蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠 安徽医科大学第二附属医院病理科，合肥 蚌埠医学院临床医学院，蚌埠 作者简介：孙帅，男，硕士研究生。：李楠，女，博士，教授，通讯作者。：亡约 例 。子宫内膜癌发病率逐年上升，在发达国家其位居女性生殖道恶性肿瘤的首位，在我国部分发达地区也有类似的趋势 。子宫内膜癌患者 年生存率约为 ；但有远处转移的患者预后差，年生存率仅为 。积极研究子宫内膜癌侵袭、进展过程中的分子事件，寻找早期诊断标志物和潜在治疗靶点，具有重要的科学意义和潜在的临床价值。是 受体家族成员，受体家族是酪氨酸激酶受体超家族中最大的亚族。有研究发现，在多种肿瘤中异常表达，且与肿瘤转移呈明显正相关 。在胃癌、非小细胞肺癌等组织中高表达，下调 可显著抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭 。本实验在体外实验中敲临床与实验病理学杂志 ；（）低和过表达子宫内膜癌细胞 内 水平，检测 在 和蛋白水平的表达，探讨子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的改变，以进一步明确 基因在子宫内膜癌中的作用。材料与方法 材料收集 年蚌埠医学院第一附属医院子宫蜡块标本，包括子宫内膜癌 例，子宫内膜不典型增生 例，正常子宫内膜 例。细胞系与试剂本组子宫内膜癌细胞 为实验室留存。胎牛血清购自美国 公司。培养基、电泳液、转膜液、缓冲液，均购自武汉塞维尔公司。抗体（）购自美国 公司；抗体（）购自英国 公司；试剂盒、小室、多聚甲醛、凝胶快速配制试剂盒，均购自上海碧云天公司。基质胶购自美国 公司；逆转录试剂购自南京诺唯赞公司；试剂购自北京全式金公司；化学发光试剂盒购自上海雅酶公司；购自美国 公司。方法 生物信息学分析 表达及靶向基因采用 数据库分析 在子宫内膜癌和癌旁组织中的表达及与子宫内膜癌临床分期的关系；通过 法在两个数据库 和 中 基因集合，按照 表达中位值进行基因富集分析；数据库寻找 相关基因。细胞培养、转染和分组用含 胎牛血清和 青霉素 链霉素抗生素的 培养基培养 细胞，置于 、培养箱中培养。待细胞长至 以上进行传代处理。细胞转染：消化后收集细胞，将细胞充分混匀后计数，接种于 孔板内，每孔约 细胞，后待细胞长至 汇合度进行转染实验，转染过程严格按 说明书进行操作，在荧光显微镜下观察转染情况，收集各组对数生长期 细胞进行后续实验。法检测 和 表达取转染后的 组细胞，按 个细胞接种在孔板中，待细胞生长至密度达 后，用冷 洗涤 次，加入 细胞裂解液后用细胞刮刮下。采用 法定量蛋白，将含有蛋白的细胞裂解液按 与 上样缓冲液混合，煮沸 ，然后进行电泳，转膜，封闭，一抗孵育过夜。将膜用 洗涤 次，每次 ，在室温下与合适的 标记的二抗孵育 。通过增强的化学发光检测系统检测蛋白条带。干扰后，设立空白对照组、阴性对照组和 组。过表达后，设立空白对照组、空载体组和过表达组。细胞增殖实验取转染后的 组细胞，将细胞以每孔 个密度均匀接种于 孔板中，并设置调零组（只含细胞培养基、不含细胞），培养于 的培养箱中培养 ，每孔加入 孵育，用酶标仪测量 处的吸光度。细胞活力计算公式：细胞活力（实验组 调零组）（空白对照组 调零组），实验重复 次，取平均值。检测细胞中 、的表达 提取试剂盒提取转染后 组和阴性对照组子宫内膜癌细胞总 ，通过超微量分光光度计测定 浓度，采用反转录试剂盒合成 。配制 反应体系，以 为内参检测 和 的表达。上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：；上 游 引物：，下游引物：。划痕迁移实验将细胞按 个 孔数量接种于 孔板中，待细胞融合度达 时，使用 枪头沿直尺垂直划直线。划线后用不含血清的培养基洗涤 次，分别于培养 、时镜下拍照并测量划痕宽度；实验重复 次。侵袭实验将 胶与 培养基按 稀释，加 稀释的 胶至 小室上室。将 小室放入 细胞培养箱中孵育 。待胶凝固后，取细胞用无血清 培养基调整细胞浓度至每毫升 个，取 加至 小室上室，将 小室置于 孔培养板中（预先加入 含 培养基）；培养 后取出小室，用棉签擦去基质胶和小室内细胞，经 多聚甲醛固定 ，结晶紫溶液染色 ；洗脱残余染液，显微镜下观察，随机选取 个视野计数穿膜细胞；实验重复 次。免疫组化法标本均经 中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规 厚连续切片，免疫组化临床与实验病理学杂志 ；（）采用 两步法染色，并统计分析 和 在癌旁组织和各级子宫内膜样癌组织中的表达。统计学分析所有数据采用 软件进行统计学分析，实验数据以珋 表示，组间均数比较采用 检验或 分析。以 为差异有统计学意义。结果 生物信息学分析 数据库分析表明：与癌旁组织相比，在子宫内膜癌中过表达，并与临床分期、病理分级、腹腔灌洗液阳性、肿瘤类型等明显相关。生存分析发现：高表达组患者的生存时间较短（，图 ）。分析 和 中 基因集合两个数据库，按照 表达中位值划分高、低后行差异基因分析，结果显示 可能与细胞黏附和细胞连接相关通路存在功能联系（图 ）；数据库寻找 相关基因显示，可能是 最具相关性的靶基因（，图 ）。法检测转染后各组中 、蛋 白 表 达 干 扰 后 组 、蛋白表达水平显著低于阴性对照组及空白对照组（，图 ）。过表达组 、蛋白表达水平显著高于空白对照组及空载体组（，图 ）。法检测转染后 、表达干扰后 表达阴性对照组：；组：。组的 、的 水平显著低于阴性对照组（，图 ）。上述结果表明，组中 、的 表图 数据库显示 在子宫内膜癌中的过表达及与临床病理特征的关系：数据库分析子宫内膜癌及癌旁正常组织中 的差异表达；表达与子宫内膜癌患者预后的关系；子宫内膜癌中 的表达与临床分期、病理分级、腹腔灌洗液、肿瘤状态、手术方式、确诊分期的关系临床与实验病理学杂志 ；（）图 采用 法按 中位值划分高、低分组选取 数据库进行基因富集分析，列出前三条相关通路；分析 数据库的 基因集合，列出前三条相关通路；采用 函数分析 在 数据库中相关通路间的联系；采用 函数分析 在 基因集合中相关通路间的联系图 数据库分析子宫内膜癌 相关基因；子宫内膜癌中 相关基因的分布曲线；基因和 基因的相关关系散点图和相关曲线临床与实验病理学杂志 ；（）图 法检测敲低和过表达 后各组中 、蛋白表达：敲低后与阴性对照组及空白对照组相比，；过表达后与空载体组及空白对照组相比，图 法检测 、的 表达：组与阴性对照组相比，达水平显著下降。敲低 基因表达对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响 细胞增殖实验检测敲低 在体外对子宫内膜癌细胞增殖的作用，结果表明：组细胞在 处的 值明显低于阴性对照组及空白对照组（，图 ），提示通过 介导的 基因敲低可显著抑制子宫内膜癌细胞系的增殖与活力。敲低和过表达 基因对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响划痕实验法检测不同分组中癌细胞的迁移能力，干扰后划痕愈合率统计分析显示：空白对 照 组：、阴 性 对 照 组：、组：。本组结果显示：组细胞划痕愈合率的细胞数明显低于阴性对照组和空白对照组（，图 ），阴性对照组和空白对照组之间穿膜细胞数差异无统计学意义，提示敲低 基因可显著降低癌细胞图 法检测敲低 对细胞增殖能力的影响：与阴性对照组及空白对照组相比，的迁移能力。过表达后划痕愈合率统计分析显示：空白对照组：；空载体组：；过表达组：。过表达组细胞划痕愈合率明显高于空载体组和空白对照组（，图 ），空白对照组和空载体组之间穿膜细胞数差异无统计学意义，提示过表达 基因可显著增强癌细胞的迁移能力。实验检测不同分组中癌细胞的侵袭能力干扰后穿膜细胞数统计分析显示：空白对照组：；阴性对照组：；组：。组细胞穿过滤膜的细胞数明显低于阴性对照组和空白对照组（，图 ），阴性对照组和空白对照组之间穿膜细胞数差异无统计学意义，表明敲低 基因可显著降低癌细胞的侵袭能力。过表达后穿膜细胞数统计分析显示：空白对照组：；空载体组：临床与实验病理学杂志 ；（）图 划痕实验检测敲低和过表达 对子宫内膜癌细胞迁移的影响：敲低后与阴性对照组及空白对照组相比，；过表达后与空载体组及空白对照组相比，空白对照组阴性对照组 组空白对照组空载体组 过表达组图 实验检测敲低和过表达 对子宫内膜癌细胞侵袭的影响：敲低后与阴性对照组及空白对照组相比，；过表达后与空载体组及空白对照组相比，；过表达组：。过表达组细胞划痕愈合率明显高于空载体组和空白对照组（，图 ），空白对照组和空载体组之间穿膜细胞数差异无统计学意义，表明过表达 基因可显著增强癌细胞的侵袭能力。不同子宫内膜组织中 和 蛋白的表达 蛋白主要定位于细胞质，在 例子宫内膜样癌组织中 例 高表达，在 临床与实验病理学杂志 ；（）例正常子宫内膜中 例 高表达，在 例子宫内膜不典型增生中 例 高表达，三组相比差异有统计学意义（）。主要定位于细胞质，在 例子宫内膜样癌组织中有 例 高表达，在 例正常子宫内膜中有 例 高表达，在 例子宫内膜不典型增生中 例 高表达，三组间差异有统计学意义（）。在 例 高表达子宫内膜样癌患者中，高分化者 例（），中分化者 例（），低分化者 例（）；在 例 高 表 达 子 宫 内 膜 样 癌 中，高 分 化 者 例（），中分化者 例（），低分化者 例（）（表 ，图 ）。表 各类子宫内膜中 、的表达组别 值值 值值正常子宫内膜 子宫内膜不典型增生 子宫内膜样癌 讨论文献报道 在多种恶性肿瘤中异常表达，且其参与恶性肿瘤发生、发展，特异性强。在肝癌、胆囊癌、皮肤癌和胶质瘤中，表达上调并促进肿瘤进展，在结肠癌中 表达缺失被证明是结肠癌进展的关键环节 。报道可与 以及 等配体结合参与 受体 配体双向信号传导 ，。在恶性肿瘤中，可与 、等分子相互作用发挥不同功能 。参与构成复杂的分子信号网络，在不同肿瘤中 与特定的分子通路相互联系，可能是其作用具有癌种特异性的原因。本实验分析 数据库显示 在子宫内膜癌中过表达，并与临床分期、病理分级、腹腔灌洗液阳性、肿瘤类型等均明显相关，生存分析发现 高表达组患者生存期较短，提示 在子宫内膜癌中可能发挥促癌作用。通过 法在 和 的 基因集两个数据库进行基因富集分析，显示 可能与细胞黏附和细胞连接相关的通路有功能联系；