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生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 485 491Current Biotechnology ISSN 20952341进展评述进展评述ReviewsCRISPR/Cas系统在斑马鱼中的研究进展王阿利，刘江东*武汉大学生命科学学院，武汉 430072摘要：斑马鱼是生物学中十分重要的模式生物，可作为基因功能分析、人类疾病病理学研究和新药研发的有利工具。它具有易于控制操作、与人类进化关系相近的优势，目前已经开发了多种斑马鱼模型用于研究人类相关疾病。聚集的有规则间隔的短回文重复序列及其关联蛋白（the clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）技术的出现，大大降低了斑马鱼基因编辑的复杂性。主要描述了CRISPR/Cas系统的基本原理、技术革新，总结了CRISPR/Cas系统在斑马鱼基因敲除或敲入、活细胞成像、转录调控、多重靶向、建立疾病模型中的重要作用，以期为探究CRISPR/Cas系统在斑马鱼基因组学研究中的应用提供一定思路。关键词：CRISPR/Cas；斑马鱼；基因编辑；基因组学研究；疾病模型DOI：10.19586/j.20952341.2023.0033 中图分类号：Q78 文献标志码：AResearch Progress on the CRISPR/Cas System in ZebrafishWANG Ali，LIU Jiangdong*College of Life Science，Wuhan University，Wuhan 430072，ChinaAbstract：The zebrafish is an important model organism in biology and a useful tool for gene function analysis，human disease pathology research，and new drug development.It has advantages of easy operation and close evolutionary relationship with humans.Currently，various zebrafish models have been developed for the study of human-related diseases.The emergence of clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins（CRISPR/Cas）technology with regularly spaced short palindromic repeats and their associated proteins has greatly reduced the complexity of zebrafish gene editing.This article mainly described the basic principles and technical innovations of the CRISPR/Cas system，and summarized the important role of the CRISPR/Cas system in zebrafish gene knockout，knock-in，live-cell imaging，transcriptional regulation，multiple targeting，and disease model establishment，with a view to providing a certain idea for exploring the application of the CRISPR/Cas system in zebrafish genomics research.Key words：CRISPR/Cas；zebrafish；gene editing；genomics research；disease model与哺乳动物不同，斑马鱼通过体外受精繁殖，可以方便地对其胚胎发育的各个阶段进行研究观察。斑马鱼的光学透明特性，使其易于结合荧光报告系统进行发育相关研究1。此外，斑马鱼的快速繁殖能力和胚胎便于基因操作特性，使其与基因组 DNA 编辑技术的结合成为必然2。CRISPR/Cas 系统相较于其他编辑系统，在斑马鱼中表现出更高的基因编辑效率和相对较低的细胞毒性3，还具有可靶向编辑甲基化序列4以及进行多重基因编辑的优势5。因此，近年来CRISPR/Cas系统在斑马鱼基因编辑领域的应用愈加广泛，并取得了一系列新突破。本文根据已有的相关报道，总结了CRISPR/Cas系统在斑马鱼基因敲除或敲入、活细胞成像、转录调控、多重靶向、疾病模型建立中的研究进展，以期从CRISPR/Cas系统在斑马鱼中应用的角度为人类疾病机制的探索提供新的思路。收稿日期：20230315；接受日期：20230331联系方式：王阿利 E-mail:；*通信作者 刘江东E-mail:生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology1CRISPR/Cas系统1.1CRISPR/Cas系统的基本作用原理CRISPR/Cas 系统是一个在古细菌和细菌中发现的内切酶工具，作用是抵抗入侵的外源遗传物质，例如噬菌体病毒、外源质粒等。同时，类似于哺乳动物的二次免疫，CRISPR/Cas系统可以为细菌提供获得性免疫，当病毒或者外源质粒入侵细菌时，细菌会形成相应的“记忆”，从而保护细菌免受外源遗传物质的二次入侵2，6。CRISPR/Cas系统可以识别并切断外源DNA或RNA，使外源遗传物质的表达沉默，此原理与真核生物中RNA干扰（RNA interference，RNAi）非常相似。正是因为具有精准靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发为一种高效的基因编辑工具并被广泛应用于工程动物基因组6-7。1.2CRISPR/Cas系统的种类CRISPR/Cas系统主要分为2类，分别为Class1和Class2，Class1系统中包含47种Cas蛋白，共同作用干扰靶基因表达，目前在斑马鱼基因编辑中应用较少；Class2系统中只有1种Cas蛋白，可单独行使多种功能，这类Cas蛋白通常具有多个复杂结构域，例如Cas9、Cas12等。而根据其剪切元件序列和功能特征，以及辅助元件的组成，Class1分为Type、3种类型，Class2分为Type、3种类型8。用于斑马鱼基因编辑的主要是Class2系统，Type、中的Cas蛋白分别为Cas9、Cas12、Cas13（表 1）。其中 Cas9和 Cas12具有基因编辑功能，由crRNA和tracrRNA人工组合成单一指导RNA（single guidence RNA，sgRNA），引导Cas9和Cas12定点切割目标序列。二者具有通过改变 sgRNA 序列即可任意改变切割位点的可控性以及便利性，因此广泛应用于斑马鱼基因组编辑。1.3CRISPR/Cas系统在斑马鱼中的技术革新虽然 CRISPR/Cas系统在基因编辑中广泛应用，但是由于细胞内修复结果的不确定性，研究者对 CRISPR/Cas 系统的编辑精度有更高的追求。在提高CRISPR/Cas系统编辑精度上的研究有以下几方面进展。1.3.1改造Cas蛋白Cas蛋白是CRISPR/Cas系统的核心组件。在斑马鱼中，通过改变核苷酸碱基从而遵循斑马鱼密码子规律，并调节 GC含量和二级mRNA结构，构建了斑马鱼密码子优化的Cas9（zCas9）cDNA。再经过体外转录，利用显微注射到斑马鱼胚胎中，能够特异性地提高 zCas9对斑马鱼基因编辑的效率17。1.3.2拓展PAM序列多样性Cas9能够识别的序列范围受到特定PAM的限制18-21。SpCas9是迄今为止使用最广泛的Cas9，主要识别NGG PAMs。由于仅限于包含该基序的位点可以被 CRISPR/Cas9系统编辑，SpCas9很难精确靶向各种基因组序列并引发基因编辑所必需的双链断裂（double strain breaks，DSBs）22。拓展PAM序列的多样性成为扩大CRISPR/Cas9应用范围的研究重点。如今在NGG PAMs之外，还发现了多种能够靶向其他PAM序列的Cas9。例如，被修饰过的化脓性链球菌Cas9（SpCas9）可以在斑马鱼细胞中特异地区分非典型NAG和NGA PAMs23；SaCas9和其 KKH SaCas9变体，可以高效率靶向编辑斑马鱼基因组中PAM为5-NNNRRT-3 的DNA序列24；ScCas9作为一种新发现的Cas蛋白，可以靶向基因组序列中更多的NNG PAMs25。PAM的多样性扩大了可用靶位点的选择范围，增加了Cas9的适用性，进一步激发了CRISPR/Cas9系统在斑马鱼基因组编辑中的潜力。1.3.3优化系统存在形式引导RNA和靶位点的互补配对，使得Cas9或Cas12能够在指定位点表1CRISPR/Cas Class2系统的种类及其特征Table 1Types and characteristics of CRISPR/Cas Class 2 systems种类CRISPR酶Cas9Cas12Cas13向导RNAsgRNAcrRNA/sgRNAcrRNAPAM序列NGGTTN目标序列DNADNARNA应用基因组编辑、活细胞成像、转录调控基因组编辑RNA编辑和示踪参考文献9-1112-1415-16注：PAMprotospacer adjacent motif，原间隔邻近基序。486王阿利，等：CRISPR/Cas系统在斑马鱼中的研究进展进行双链切割，引导RNA的不稳定靶向，大大降低了 CRISPR/Cas9 和 CRISPR/Cas12 的基因编辑效率。研究表明，sgRNA 5 端多余的鸟嘌呤核苷酸会导致斑马鱼胚胎内CRISPR/Cas9编辑能力降低26。在 Cpf1（更名为 Cas12a）蛋白缺失的情况下，crRNA（Cpf1的向导RNA）在体内不稳定并发生降解14。以上2种情况都可以通过将CRISPR/Cas系统组装成核糖核蛋白复合物以提高其对基因组编辑的稳定性和有效性26-27。1.3.4改变载体组分不同的 CRISPR/Cas 系统载体构成具有不同的编辑效果。在质粒载体的CRISPR/Cas系统中，以组织特异性的启动子启动系统表达，就可以获得针对特定组织结构的基因编辑工具，进而对不同的组织进行特异性基因编辑操作28。1.3.5选择合适的温度环境也会影响CRISPR/Cas系统在斑马鱼中的使用效果。有研究表明，降低温度有利于延缓斑马鱼胚胎早期发育，提高CRISPR/Cas9的编辑效率29。2CRISPR/Cas系统在斑马鱼基因编辑中的应用2.1利用 CRISPR/Cas 系统对斑马鱼进行基因敲除或敲入Cas9和Cas12蛋白都可以用作基因敲除或敲入，通过引入双链断裂、非同源端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复或同源定向修复（homologous directed repair，HDR）均可以诱导目的基因的插入或缺失（indels）30。但由于供体和断点之间的连接是不可预测的，修复后突变的结果通常并不理想，特别是HDR介导的基因组编辑敲入方法在斑马鱼中效率更低31。因此，研究者提出了很多办法来提高插入/缺失效率。针对HDR导致的突变效率低的问题，在斑马鱼胚胎中引入斑马鱼长单链DNA模板（zebrafish long single-stranded DNA template，zLOST），利用HDR 和长单链 DNA（long