circ_0000515_miR-1296-5p_CDK2轴在乳腺癌中的作用.pdf

第 卷第 期 年 月江 苏 大 学 学 报(医 学 版)()./轴在乳腺癌中的作用杨琴 王超 蔺博涵 虞绮雯 李涛 孙晓春(.江苏大学附属四院妇女保健科江苏 镇江 .江苏大学医学院江苏 镇江)摘要 目的:探究 在乳腺癌进展中的可能作用机制 方法:通过 数据库下载乳腺癌 芯片数据集()并采用 语言进行表达差异分析筛选出目标 分子作为研究对象并检测其在乳腺癌细胞株和组织中的表达生物信息学分析与选择该 的目的 及后者对应的靶向 并采用双荧光素酶实验和蛋白质印迹进行验证将目标 的 转染人乳腺癌 和 细胞 实验和划痕实验观察细胞的增殖和迁移荧光定量()检测 表达蛋白质印迹实验检测 编码蛋白的表达 结果:选择和下载 数据集后用 语言筛选出 个高表达的 分子选定其中的 作为研究对象生物信息学分析得出、和细胞周期蛋白依赖性激酶()三者之间可能存在靶向关系 结果显示 中乳腺癌细胞株 和 中的表达明显高于人乳腺上皮细胞株 在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织中的表达 抑制 表达后乳腺癌细胞增殖和迁移能力较对照组显著下降 表达明显增高双荧光素酶实验证实 与 之间存在靶向关系 蛋白质印迹实验证实抑制 表达后 蛋白表达明显减低 结论:在乳腺癌中高表达可能通过/作用轴影响乳腺癌进展关键词 乳腺癌细胞周期蛋白依赖性激酶 机制中图分类号.文献标志码 文章编号 ():./.引用格式杨琴王超蔺博涵等./轴在乳腺癌中的作用.江苏大学学报(医学版)():.基金项目镇江市社会发展项目()作者简介杨琴()女副主任医师:并列第一作者孙晓春(通讯作者)教授硕士生导师:./(.):.:().:.().:./.据 年世界卫生组织国际癌症研究机构最新癌症数据报告 年全球新发癌症病例 万例其中乳腺癌新发病例高达 万例超过肺癌的 万例成为全球第一大癌(占新发病例的.)是女性死亡率最高的癌症之一 非编码()因其在调节细胞代谢和肿瘤进程中的重要作用近年来已经成为肿瘤研究的热点受到广泛关注 研究表明的失调可以引起多种疾病的发生并可以作为多种肿瘤的潜在分子标志物 是一大类呈共价闭合环状结构的特殊 与一般的线性 的标准剪接不同 是通过反向剪接产生的最终形成共价闭合结构 微小()是一类长度约 个核苷酸的小 在调节细胞周期、细胞增殖等多个方面起重要作用 目前普遍认为 通过 的分子海绵效应发挥作用 本研究旨在探明 在乳腺癌发生发展中的作用机制 材料与方法.材料.临床标本 临床乳腺癌及癌旁组织 例标本取自江苏大学附属四院外科(经患者知情同意和江苏大学伦理委员会批准)患者全部为女性年龄(.)岁所有乳腺癌标本均经过临床病理学证实为浸润性乳腺癌其中 例存在淋巴结转移.主要试剂 、胎牛血清和胰酶(美国 公司)试剂盒(公司)、阴性对照()双荧光素酶报告基 因 检 测 试 剂 盒 和 均购自苏州吉玛公司兔抗人 单克隆抗体(美国 公司)、兔抗人细胞周期蛋白依赖性激酶()多克隆抗体(沈阳万类生物科技有限公司)试剂盒和 转染试剂盒(美国 公司).方法.数据库下载及差异分析从 数据库 下 载 乳 腺 癌 与 癌 旁 组 织 芯 片 数据集随后通过 语言 包分析乳腺癌中的 差异表达谱(设定阈值为 校正 值.为差异倍数)./网络构建通过(:/./)在线网站预测差异表达的 相互作用的靶向 分 子 然 后 通 过.(:/./)数据库、.(:/./.)以及(:/./)预测 调控的 分子.细胞培养与传代人乳腺癌细胞株 和 用含 胎牛血清的 高糖完全培养基置于、的饱和湿度培养箱中培养人乳腺上皮细胞株 使用(.)完全培养基于 、的饱和湿度培养箱中培养 待培养细胞融合度达到以上时胰酶消化细胞按照 比例加入相应的培养基进行传代.细胞转染 转染前 取对数生长期且生长状态良好的 和 细胞弃去原培养基 洗涤 次胰酶常规消化后用含胎牛血清无双抗的 高糖完全培养基重悬制成单细胞悬液计数并调整细胞密度为 个/在 孔板中加入 细胞悬液即 个/孔然后将 孔板置于 、的饱和湿度培养箱中继续培养次日待贴壁细胞融合度达到左右时根据 转染试剂说明书进行转染 转染前培养基更换为无双抗的 培养基阴性对照组更换为含(/)的 培养基 组更换为含 江苏大学学报(医学版)第 卷(/)的 培养基继续培养 和 的浓度为 /.实验测定细胞增殖能力分别接种转染 或 的 和 细胞至 孔板内每孔接种约 个细胞每组 个孔重复 继续培养 后每孔加 试剂 在培养箱内继续孵育 后于酶标仪 波长检测每孔光密度()值.划痕实验测定细胞迁移能力乳腺癌细胞 和 在 孔板转染 或 后待细胞融合度达到 以上时用无血清 饥饿培养 在超净工作台中用 移液枪枪头用载玻片作依靠垂直孔板平面在每孔中心轴画 条直线弃原培养基 轻轻冲洗 遍洗掉脱落细胞加入 无血清培养基置于倒置显微镜下观察并选取 个视野拍照记为 、培养箱中继续培养划痕 后置于倒置显微镜下观察拍照并记录为 使用 分析细胞划痕面积并计算划痕愈合率划痕愈合率()(划痕面积 划痕面积)/划痕面积.提取与 检测 和 表达采用 法提取组织和乳腺癌细胞株中的总 测量 浓度并用相应的试剂盒逆转录合成 打开实时荧光定量 仪按照操作说明设置反应程序运行 标准反应程序 反应体系为 反应条件:酶激活 预变性 变性 退火 延伸 个循环实验结束之后分析数据(法)以 作为 的内参以 作为 的内参 引物序列如下:上游 下 游 上游 下游 上游 下 游 上 游 下游.蛋白质印迹实验测定乳腺癌细胞中 蛋白的表达转染 或 并培养 后提取乳腺癌细胞 和 总蛋白利用核酸蛋白浓度检测仪检测上清液中总蛋白的浓度并记录配制电泳胶于电泳设备中加入总蛋白样本 后加压至 继续电泳直至不同分子量蛋白分离在 下将蛋白转至 薄膜上并使用 封闭液封闭 洗膜将 膜分别放入含兔抗人 抗体、兔抗人 抗体(内参)的一抗稀释液()中 孵育过夜加二抗室温孵育 使用 显影液进行曝光再用 软件进行灰度扫描.双荧光素酶报告基因实验 将 的野生型()或突变型()克隆到 启动子荧光素酶载体 按照试剂制造商说明使用 将 和 野生型或突变型转染 细胞 后通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性.统计学分析应用 .进行相关统计学分析并进行绘图 两组间比较采用配对样本 检验.为差异有统计学意义 结果.在乳腺癌中高表达采用 语言 包进行 数据集的差异分析后得出有 个 的表达明显上调(、以及)结果显示 对临床配对标本乳腺癌组织中 的相对表达水平明显高于癌旁组织中的表达(.)在 和 细胞中的表达水平明显高于人乳腺上皮细胞株(:.:)见图 因关于乳腺癌组织中 的研究报道少见且经细胞和组织的 初步验证其高表达所以最终确定 作为研究对象图 在乳腺癌细胞和癌组织中的表达第 期杨琴等./轴在乳腺癌中的作用.对乳腺癌细胞增殖能力的影响相较于 组 组在 处的 值显著降低(图)即敲低 的表达水平能够显著抑制乳腺癌细胞(.)和(.)的增殖能力图 敲低 后乳腺癌细胞株的增殖能力下降.对乳腺癌细胞迁移能力的影响划痕实验结果表明 组的乳腺癌细胞均比 组的乳腺癌细胞划痕愈合率显著降低(:.:.)见图.、与 之间的靶向关系通过 在线网站以及 数据库预测 潜在的靶向 结果表明 与 存在相互结合位点(图)然后再通过 数据库进行生物信息学分析继续寻找 的可能靶点发现 含有 的结合位点(图)且结合效能较高()然后利用工具细胞采用双荧光素酶报告基因实验检测 与 的结合 将 与 报告基因质粒共转染 细胞结果显示 表达上调后 报告基因质粒荧光素酶活性明显降低(.图):细胞划痕实验:细胞划痕实验图 敲低 后乳腺癌细胞株的迁移能力下降:与 之间的结合位点:与 之间的结合位点:双荧光素酶实验检测荧光素酶活性表达率图 、与 之间的靶向关系.敲低 表达对 表达的影响 结果显示在 和 细胞株中 组 的表达量均显著低于 组的表达(:)见图 这说明敲低 的表达可促进 的表达 江苏大学学报(医学版)第 卷图 检测敲低 后乳腺癌细胞 的表达.敲减后乳腺癌细胞中 的表达水平本研究利用 数据分析癌症基因组图谱()乳 腺 癌 组 织 中 和 的表达水平发现 在肿瘤组织中的表达低于癌旁组织而 在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织 蛋白质印迹实验结果显示(图)在乳腺癌细胞 和 中 的下调可以显著抑制 蛋白的表达图 敲低 后乳腺癌细胞 蛋白的表达 讨论越来越多的研究证实 在乳腺癌中存在差异表达并可以调控乳腺癌的发生、转移、侵袭和耐药表明 可作为乳腺癌的诊断生物标志物和治疗靶点 本研究先采用 语言 包对乳腺癌 芯片数据集()进行表达谱差异分析发现在乳腺癌组织中存在 个表达上调的 根据文献报道肿瘤类型和初步的实验验证最终选定 作为研究对象 本研究结果表明 在乳腺癌细胞株 和 中的表达量均明显高于乳腺上皮细胞株 例配对临床标本检测也显示 在乳腺癌组织的表达显著高于癌旁组织 敲低 表达后 和 细胞的增殖和迁移能力较未敲低组均显著性减弱 有研究表明 可以作为 海绵通过上调 样激酶()促进宫颈癌进展亦有文献报道在肝细胞癌组织和细胞系中表达上调并可用于预测肝癌的肿瘤分期、淋巴转移和预后同时其可以通过下调促分裂原活化蛋白激酶()加重肝细胞癌的恶性进展以上结果均表明 可能在肿瘤进展中起到一个促癌基因的角色目前众多学者认为 可通过与 结合并抑制后者与 之间的相互作用从而间接影响 下游靶基因和蛋白的表达 本研究通 过 生 物 信 息 学 预 测 了 与、与 之间存在互作关系通过双荧光素酶实验也证实了 与 之间存在相互作用 随后的蛋白质印迹实验结果显示在乳腺癌细胞株 和 中下调 表达可以显著抑制 蛋白的表达 这些结果证实在乳腺癌中存在/作用轴其可能在乳腺癌进展中发挥重要作用 等研究证实 在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织多个乳腺癌细胞系中 的表达量明显高于正常乳腺上皮细胞株 且证实了/作用轴在乳腺癌中起着重要作用 本研究结果与之相近 以上研究也说明单一 分子可能通过多个不同分子通路发挥其生物学效应综上所述本研究结果表明 在乳腺癌中高表达且/作用轴可能参与乳腺癌的进展 因此/作用轴可为乳腺癌的诊断与治疗提供潜在的靶标参考文献 .:.():.:第 期杨琴等./轴在乳腺癌中的作用 .():.():.:.():.():.王超 高雨婷 刘子瑶 等.通过靶向谷氨酸受体相互作用蛋白 影响乳腺癌细胞的增殖和迁移.江苏大学学报(医学版)():.():.:.:.():.:.():.()():.():.():./.():.收稿日期 编辑 何承志(上接第 页).():.:.():.:.():.():.:.():.:.:.():.():.:.():./.():.():.收稿日期 编辑 刘星星 江苏大学学报(医学版)第 卷