CD8 T细胞通过抑制小胶质细胞抗原提呈对小鼠EAE模型复发期的保护作用.pdf

6期多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统（CNS）慢性自身免疫性脱髓鞘疾病，临床显著特点是病程呈典型缓解复发过程且神经功能缺损症状累积性加重1-2。人工合成MOG35-55肽段被动免疫雌性 C57BL/6 小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE）模型在诸多方面与 MS 具有较高相似性，既可以引起 CNS 的 T 细胞免疫应答，又能够诱导临床缓解复发过程，是研究MS 发病机制和致病作用的理想动物模型3-4。MS/EAE 临床治疗效果不佳，难以有效逆转进行性神经功能障碍的根本原因是疾病复发5。目前普遍认为，CD4+T 淋巴细胞是 MS/EAE的主要致病因素6-7，CD8+T 细胞在 MS/EAE 中可能也起到一定作用8。早期实验研究9结果表明，活化 CD8+T 细胞仅针对体内靶细胞产生杀伤和细胞毒效应，通过诱导细胞凋亡导致组织免疫病理损伤。近年来，越来越多的证据10-11提示 CD8+T 细胞对许多慢性自身免疫性疾病复发过程发挥免疫保护和调节作用。在细胞水平，活化 CD8+T 细胞免疫负调节可能的作用机制包括：抑制效应 CD4+T 细胞共刺激分子表达，通过杀伤作用抑制抗原提呈细胞对 CD4+T 细胞及自身的抗原提呈下调应答强度12。在分子水平，其可能的作用形式主要有：以 MHC玉类分子限制方式识别抗原提呈细胞提呈的抗原肽，建立免疫突触，向靶细胞输送颗粒酶 B 进而诱导凋亡9；通过自身诱导表达的 FasL 与靶细胞膜表面 Fas 分子以细胞间相互接触形式引起靶细胞凋亡信号通路激活13；利用 TNF-琢/TNFR 之间配-受体相互作用经靶细胞死亡结构域触发细胞凋亡14。CD8+T 细胞在 EAE/MS 中免疫调节的具体作用机制尚未完全阐明，本研究通过 MOG35-55抗原肽构建小鼠 EAE 模型，基于 T 细胞活化和效应收稿日期：2023-02-15基金项目：国家自然科学基金项目（30010505）作者简介：田会丽（1991），女，在读硕士研究生，研究方向：中枢神经系统感染与免疫。通信作者：周翔鱼（1971），男，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中枢神经系统感染与免疫。E-mail：CD8+T 细胞通过抑制小胶质细胞抗原提呈对小鼠 EAE 模型复发期的保护作用田会丽1，李娜2，胡进1，3，曹羿堃2，周翔鱼1，2（1.宁夏医科大学，银川750004；2.石嘴山市第一人民医院，石嘴山753200；3.宁夏医科大学总医院，银川750004）摘要：目的探讨 CD8+T 细胞在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）复发期的部分免疫效应及其作用机制。方法将 30 只 68 周雌性 C57BL/6 小鼠随机分为对照组和 EAE 模型组，每组 15 只；EAE 模型组给予髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）人工被动免疫；免疫当日起进行临床神经功能评分；透射电子显微镜（TEM）观察髓鞘结构变化；流式细胞术检测脾脏 T 细胞亚群变化；单细胞转录组测序分析中枢神经系统免疫反应表型及相关基因表达差异；微量样本多指标流式（CBA）检测脑组织中细胞因子表达水平；RT-qPCR 检测脑组织中主要组织性相容复合物（MHC）分子、Fas、FasL 和颗粒酶 B 基因表达。结果MOG35-55多肽可以成功诱导雌性 C57BL/6 小鼠 EAE 缓解复发模型；EAE 模型组小鼠复发期脾脏中 T 细胞免疫应答较对照组升高（P约0.05）；脑组织内出现大量 T 淋巴细胞浸润，免疫效应以 Th1 细胞为主；小胶质细胞中 MHC玉及 MHC域类分子基因表达上调（P均约0.05），且诱导表达 MHC域类分子的小胶质细胞几乎同时伴随 MHC玉类分子的共表达，未见 MHC域类分子的独立表达；CD8+T 细胞杀伤效应相关分子 Fas 基因、TNF-琢 基因表达差异均无统计学意义（P均园.园缘）；颗粒酶 B 基因表达量增高（P约0.01）。结论CD8+T 细胞可能通过颗粒酶 B 杀伤 MHC玉类分子和 MHC 域类分子共表达的小胶质细胞，通过减弱 MHC 域类分子对 CD4+T 细胞活化，间接抑制复发期炎性反应，发挥免疫负调节作用。关键词：实验性自身免疫性脑脊髓炎；多发性硬化；CD8+T 细胞中图分类号：R744.5文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.005第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University文章编号：1674-6309（2023）06-565-08论著565窑窑宁夏医科大学学报4缘卷的 MHC 分子限制性原则，初步探讨 CD8+T 细胞在 EAE 复发期中的应答类型及部分作用机制，以期为临床有效治疗 CNS 自身免疫性疾病提供一定的实验基础。1材料与方法1.1实验动物6耀8 周健康雌性 C57BL/6 小鼠 30 只，由宁夏医科大学实验动物中心提供 SCXK（宁）2020-0001，小鼠为 SPF 级，饲养于温度（22依3）益、相对湿度（60依5）%、维持光-暗 12 h 循环交替的环境中，给予充足的食料和洁净的饮水。所有动物均经宁夏医科大学实验动物伦理委员会批准使用（批准编号：IACUC-NYLAC-2022-120）。1.2主要试剂与仪器设备人工合成髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55，纯度逸95%，氨基酸序列：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys）购自美国 AnaSpec公司；百日咳毒素（PTX）购自美国 List BiologicalLabs 公司；弗氏完全佐剂（CFA）购自美国 Sigma公司；结核分枝杆菌（H37Ra）购自美国 BD Bio原sciences 公司；流式抗体 FITC-CD3、APC-CD4、PerCP-Cy5.5-CD8、Brilliant Violet 510-CD69 购自 美国 BioLegend 公 司；RNAsimple Total RNAKit 购自天根生化科技（北京）有限公司；Prime原ScriptTMRT Master Mix 购自日本 TaKaRa 公司；BestarRSybrGreen qPCR Master Mix 购自 德 国DBI Bioscience 公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成；透射电子显微镜（TEM）购自泰思肯贸易（上海）有限公司；流式细胞仪购自美国 BD Biosciences 公司；荧光定量 PCR 仪购自美国 Bio-Rad 公司；生物安全柜购自江苏益康电器有限公司。1.3实验方法1.3.1EAE 模型的构建C57BL/6 小鼠随机分为对照组和 EAE 模型组，每组 15 只。MOG35-55多肽用无菌 PBS 配制，终浓度为 3 mg mL-1，与等体积含 8 mg mL-1结核分枝杆菌的 CFA 充分混合制备成油包水样乳剂，抗原肽制备在生物安全柜中进行。小鼠麻醉后，EAE 模型组在腋窝和腹股沟平面脊柱两侧 4 个点位皮下注射共 0.2 mL 乳剂，在免疫第 0 h 和第 48 h 腹腔注射 200 滋LPTX（2.5 mg mL-1），对照组不做任何处理。从免疫第 0 天到第 40 天实验终止前，每日监测小鼠精神状态并进行神经功能评分。随机挑选复发期（3135 d，神经功能评分逸3 分）小鼠行以下实验。1.3.2神经功能评分EAE 评分参考国际通用评分标准4，15：无症状为 0 分；尾部张力消失为 1分；尾部张力消失、双后肢无力为 2 分；双后肢瘫痪为 3 分；四肢全瘫为 4 分；濒死状态或死亡为 5 分。临床症状在两评分标准之间的按依0.5分计。1.3.3TEM 观察髓鞘超微结构变化随机选取对照组和复发期小鼠，麻醉后处死，取出脑组织胼胝体，切成 1 mm3左右大小后放入 3%戊二醛溶液中固定，经锇酸固定、丙酮脱水、环氧树脂包埋处理后，TEM 观察髓鞘超微结构变化。通过Image J 软件，从 10 000 倍图像中随机选取 30 个有髓轴突，计算轴突总直径/纤维总直径（g-ratio），g-ratio 值越大，说明髓鞘越薄16。1.3.4流式细胞术分析脾脏 T 细胞亚群变化随机选取对照组和复发期小鼠，麻醉后处死，取出脾脏，经研磨、裂解红细胞、清洗后，将细胞浓度调整为 1伊107/mL，4 益保存备用。取 100 滋L 细胞悬液加入流式管中，加入抗体 CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PerCP-Cy5.5、CD69-BV510 各 2 滋L进行表面染色，4 益避光孵育 30 min，缓冲液清洗后上机检测。1.3.5单细胞转录组测序随机选取对照组和复发期小鼠，麻醉后处死，取出脑组织，立即放入组织保存液中，经清洗、酶消化、过筛、去碎片和红细胞裂解等步骤，将组织制备成单细胞悬液，并进行细胞计数和细胞活化率检测，将细胞浓度调整为 1伊106/L。利用微流控芯片将制备好的细胞悬液包裹在液滴中，最后根据 10伊基因组学方案制备单细胞文库。1.3.6微量样本多指标流式（CBA）测定脑组织细胞因子水平将对照组和复发期小鼠麻醉后处死，取出脑组织，生理盐水清洗后吸干表面水分，取 50 mg 脑组织加入 500 滋L 预冷 1640 培养基，冰浴研磨匀浆，离心取上清液，按照 CBA 试剂盒操作步骤检测上清液中白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-17A（IL-17A）、干扰素-酌（IFN-酌）和肿瘤坏死因子-琢（TNF-琢）含量。1.3.7RT-qPCR 检测 MHC玉/域类分子、Fas/FasL和颗粒酶 B mRNA 相对表达量按照 RNA 提取试剂盒操作步骤，提取小鼠脑组织总 RNA，微量核酸蛋白浓度测定仪检测 RNA 浓度，OD260/OD280为 1.8耀2.0。按照反转录试剂盒操作，将 RNA 反566窑窑6期转录为 cDNA，RT-qPCR 检测 H2-K1、H2-D1、H2-Aa、H2-Ab、H2-Eb、Fas、FasL 和颗粒酶 B 分子的 mRNA 表达变化。使用 2-驻驻Ct计算目的基因相对表达量，所用 RT-qPCR 引物序列见表 1。引物名称GAPDHH2-K1H2-D1H2-AaH2-AbH2-EbFasFasLGranzyme B上游引物（5-3）下游引物（5-3）GGTTGTCTCCTGCGACTTCATGGTCCAGGGTTTCTTACTCCGCCTCCTCCATCCACTGTCTCCGAAACACAGGTGGAAAAGGAGGGGGAAGTGGGCATATGTGGTGGTGCTCCTCCGTCCACTGACTCTTACATGGAGACATTGGCCAGTACACATGCTTCCTGAGTTTGGCCAAAGCAGCCCAGGGACTGAGGCCCAATGTCGTCATCTCCGACCTGGCTCCTCCTGATTCTCCCTGTCCCCTTTTGTCCCTTGCCGGCGGGTTCGTGAAACTGATTTGCTGTCAACCATGCCAACCAGCAGCCCATGAATTACCCCCATCTTGTGGGCCTAGAGGCAAACGTGCTTCCTTTCGGGAAGGATGGTTCACCTCCACG表 1RT-qPCR 引物序列1.4统计学方法数据采用 GraphPad Prism 软件进行统计学分析与作图。符合正态分布的计量资料以均数依标准差（x依s）表示，两组间比较采用 t 检验。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组小鼠神经功能评分如图 1 所示，EAE 模型组小鼠在免疫后第11 天左右开始出现临床症状；第 18 天左右症状达到峰值，出现双后肢全瘫、双前肢无力、拖行等表现；之后症状逐渐缓解，但不能完全