癌相关成纤维细胞经VEGF_VEGFR2 轴对口腔鳞状细胞癌血管生成的影响.pdf

基础医学文章编号:1002-0217(2023)04-0312-05基金项目:江苏省自然科学基金面上项目(BK20171483);皖南医学院中青年科研基金项目(XJ2021002303)收稿日期:2022鄄11鄄02作者简介:姚摇 禹(1987鄄),男,主治医师,(电子信箱)yaoyu0421 ;王摇 琼,女,讲师,(电子信箱)wangqcandy ,通信作者。癌相关成纤维细胞经 VEGF/VEGFR2 轴对口腔鳞状细胞癌血管生成的影响姚摇 禹1,朱秀安2,王摇 琼1(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院摇口腔科,安徽摇芜湖摇241001;2.皖南医学院摇口腔医学院,安徽摇芜湖摇241002)揖摘摇 要铱目的:以人口腔鳞状细胞癌(OSCC)相关成纤维细胞(CAFs)为研究对象,观察 CAFs 经血管内皮生长因子(VEGF)/VEGF 受体(VEGFR)2 轴对 OSCC 肿瘤血管生成的作用及其可能机制。方法:通过形态学观察、RT鄄qPCR、Western blot 和免疫荧光等技术鉴定 CAFs、正常成纤维细胞(NFs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离;采用 ELISA 对 CAFs 和 NFs 条件培养基(CM)中的 VEGF 表达水平进行定量分析;构建 CAFs、NFs 和 HUVECs 的共培养模型,通过小管形成实验检测 CAFs、VEGF/VEGFR2 和血管生成之间的关系;构建裸鼠皮下移植瘤模型,利用 HE 染色、免疫组织化学染色(IHC)等比较 CAFs、VEGF/VEGFR2、血管生成和移植瘤生长之间的关系。结果:成功培养和纯化了 CAFs、NFs 和 HUVECs,RT鄄qPCR 和 Western blot 显示琢鄄SMA、FAP 和 FSP鄄1 在 CAFs 中的表达高于 NFs。HUVECs 对内皮细胞标记物 CD31 免疫荧光染色阳性而对平滑肌细胞标记物 琢鄄SMA 染色阴性。与 NFs 相比,CAFs 显著促进 HUVECs 的小管形成,VEGFR2 抑制剂可有效减弱 CAFs 的促小管形成能力。动物实验和瘤体切片染色结果显示 CAFs 促进裸鼠异种移植模型中的 OSCC 细胞肿瘤生长及血管生成,同时 IHC 检测到琢鄄SMA、CD31、VEGF 和 VEGFR2 均在与 CAFs 混合注射的瘤体中表达更高。结论:CAFs 经 VEGF/VEGFR2 轴促进 OSCC 的血管生成,可能是 OSCC 潜在的治疗靶点。揖关键词铱口腔鳞状细胞癌;肿瘤微环境;癌相关成纤维细胞;肿瘤血管生成;血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体 2揖中图号铱R 739郾 8;R 392郾 12摇 摇 摇 揖文献标志码铱A揖DOI铱10郾 3969/j.issn.1002鄄0217.2023.04.002Cancer鄄associated fibroblasts promoting angiogenesis in oral squamous cell carcinoma viaVEGF/VEGFR2YAO Yu,ZHU Xiu忆an,WANG QiongDepartment of Stomatology,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China揖Abstract铱Objective:Human oral cancer鄄associated fibroblasts(CAFs)were used to investigate the molecular mechanisms by which CAFs promotedtumor angiogenesis in oral squamous cell carcinoma(OSCC)through the VEGF/VEGFR2 axis.Methods:The isolates of CAFs,normal fibroblasts(NFs)and human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)were identified by morphological observation,RT鄄qPCR,Western blot and immunofluorescence.The expression of VEGF in conditioned medium(CM)of CAFs and NFs was quantified by ELISA.The co鄄culture model of CAFs,NFs and HUVECs wasconstructed,and the relationship between CAFs,VEGF/VEGFR2 and angiogenesis was detected by tube formation assay.A nude mouse subcutaneoustransplantation tumor model was constructed,and HE staining and immunohistochemical staining(IHC)were used to compare the relationship betweenCAFs,VEGF/VEGFR2 angiogenesis and tumor growth.Results:CAFs,NFs and HUVECs were successfully cultured and purified.RT鄄qPCR and Westernblot showed that the expressions of 琢鄄SMA,FAP and FSP鄄1 were significantly higher in CAFs than those in NFs.HUVECs showed positiveimmunofluorescence staining for endothelial cell marker CD31 but negative staining for smooth muscle cell marker 琢鄄SMA.Compared with NFs,CAFssignificantly promoted tubule formation in HUVECs,and VEGFR2 inhibitors effectively attenuated the pro鄄tubule formation ability of CAFs.Animalexperiments and tumor section staining results showed that CAFs promoted tumor growth and angiogenesis of OSCC cells in nude mouse xenograft model,and IHC detected that 琢鄄 SMA,CD31,VEGF and VEGFR2 were all highly expressed in tumor sections mixed with CAFs.Conclusion:CAFs can promoteangiogenesis through VEGF/VEGFR2 pathway in OSCC and may be a potential therapeutic target for OSCC.揖Key words铱 oral squamous carcinoma;tumor microenvironment;cancer鄄associated fibroblast;tumor angiogenesis;vascular endothelial growth factor/VEGF receptor 2213皖南医学院学报(J of Wannan Medical College)2023;42(4)摇 摇 口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔癌的 90%以上,是一种常见的恶性肿瘤,具有快速局部迁移、转移和高复发率的倾向,在世界范围内具有相当高的发病率和病死率1。OS鄄CC 细胞的迁移和转移潜能不仅取决于肿瘤细胞的特性,还取决于与肿瘤微环境(tumor microenviron鄄ment,TME)中基质细胞的相互作用。癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)作为肿瘤基质中最为丰富的细胞,已被证明是癌症进展的主要参与者2。CAFs 能够通过多种机制促进肿瘤发生发展,包括介导细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重塑,促进癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT),促进可溶性生长因子或细胞因子的分泌等,此外 CAFs还可通过诱导血管生成,促进肿瘤的侵袭转移2-5。血管生成是恶性肿瘤发展的重要机制6。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是调节血管生成的关键生长因子,VEGF 和VEGF 受体(VEGF receptor,VEGFR)是许多实体肿瘤或血液系统恶性肿瘤中与肿瘤血管生成相关的主要血管生成诱导剂7。目前的研究证实,VEGFR2在 VEGF 的信号转导及血管内皮生成中起主导作用8。因此,VEGFR2 成为当前抗肿瘤血管生成研究的热点。本研究拟通过细胞实验和动物整体实验,探究 CAFs 促进人脐静脉内皮细胞(human um鄄bilical vein endothelial cells,HUVECs)血管生成的可能机制。1摇 材料与方法1.1摇 材料摇 BALB/c 裸鼠,5 6 周龄,雌性,体质量18 20 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。人 OSCC 上皮细胞株 CAL27 购自美国 ATCC。rabbit anti鄄琢鄄SMA、mouse anti鄄CD31、rabbit anti鄄VEG鄄FR2(Cell Signaling Technology 公司,美国),rabbitanti鄄FSP鄄1、rabbit anti鄄FAP(Abcam 公司,美国),rab鄄bit anti鄄VEGF、mouse anti鄄茁鄄actin(Proteintech 公司,美国),抑制剂 Ki8751(MedChemexpress 公司,美国)。1.2摇 方法1.2.1摇原代 HUVECs、CAFs 和正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)的分离培养摇 将新鲜的 OS鄄CC 及癌旁组织置于无菌操作台内,用含 3%双抗的PBS 反复冲洗后,剪成 1 mm3的小块,铺于培养皿内,置于原代培养箱中贴壁 2 4 h 后加入含 15%FBS 的高糖培养基,2 3 d 更新培养基。约 5 7 d可见细胞从组织内爬出,再通过差别酶消化法纯化成纤维细胞,经过 2 3 次传代后,可获得纯化的CAFs 和 NFs,并做进一步鉴定。将新鲜脐带置于无菌操作台内,用含 3%双抗的 PBS 冲洗脐带,然后向脐静脉腔内注入 0郾 1%的玉型胶原酶,置于 37益下消化 20 min,随后用 ECM培养基洗涤消化产物,收集并离心。将颗粒重悬于ECM 培养基中接种在培养瓶中,置于原代培养箱中培养。24 h 后,用 PBS 冲洗 HUVECs 以去除非黏附细胞,第 3 代细胞用于实验。1.2.2摇条件培养基(conditioned medium,CM)的制备摇 细胞生长至 60%70%汇合时,将培养基更换为无血清的 DMEM 高糖培养基,继续培养 24 h 后,收集上清液,离心或通过 0郾 22 滋mol/L 滤器过滤,分装并储存于-80益。1.2.3摇 细胞