VPS13A在3T3-L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究.pdf

世界卫生组织发布的最新数据表明全球肥胖发病率越来越高。全球肥胖患病率的大幅增加一方面可能是由于营养摄入过多以及运动量不足引起的，另一方面也可能是由于遗传和生物等因素所引起的。白色脂肪组织通过增加脂肪细胞的大小或促进脂肪前体细胞的分化增加脂肪细胞数目而扩张，进一步引起肥胖症的发生1。脂肪组织在机体能量代谢过程中起着重要作用2，相关研究表明肥胖与2型糖尿病、高血压等疾病之间具有明显相关性3。因此对脂肪细胞分化机制的深入研究可以为肥胖的防治提供重要的理论基础及潜在的靶VPS13A在3T3L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究刘瑾，黄昀，李超普，张桐，潘锦堃，季学涛，张许，李仲*南京医科大学罕见代谢性疾病研究重点实验室，南京医科大学生物化学与分子生物学系，江苏省人类功能基因组重点实验室，江苏南京211166摘要 目的：明确囊泡分选蛋白13A（vacuolar protein sorting 13 homolog A，VPS13A）在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast cells，3T3L1）分化过程中的表达水平；探索VPS13A对3T3L1细胞的影响。方法：利用Western blot及QPCR法检测3T3L1细胞在分化过程中VPS13A的表达，利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系，Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3L1细胞分化的影响。结果：VPS13A的表达在3T3L1分化过程的早期降低，在分化的后期升高。敲降VPS13A后，3T3L1细胞中脂滴增多，参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论：在3T3L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控，敲降VPS13A可以促进3T3L1细胞的分化成熟。关键词 VPS13A；3T3L1细胞；脂滴；脂肪细胞分化中图分类号 R329.26文献标志码 A文章编号 10074368（2023）08104106doi：10.7655/NYDXBNS20230801Expression and regulation of VPS13A in 3T3L1 adipocyte differentiationLIU Jin，HUANG Yun，LI Chaopu，ZHANG Tong，PAN Jinkun，JI Xuetao，ZHANG Xu，LI Zhong*Key Laboratory of Rare Metabolic Disease，Department of Molecular Biology and Biochemistry，Nanjing MedicalUniversity，the Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province，Nanjing 211166，ChinaAbstractObjective：To determine the expression level of vacuolar protein sorting 13 homolog A（VPS13A）during celldifferentiation of 3T3L1 and to explore the effects of VPS13A on 3T3L1 cells.Methods：Western blot and QPCR were used to detectthe expression changes of VPS13A during the differentiation of 3T3L1 cells，and CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats）/Cas9（CRISPR associated with 9）system to establish stable VPS13A knowdown cell lines.Finally，the effect ofVPS13A knockdown on 3T3L1 cell differentiation was detected by Western blot and Oil red staining.Results：The expression ofVPS13A was downregulated in the early stage and upregulated in the later stage of 3T3L1 cell differentiation.Lipid droplets and theexpression levels of genes involved in differentiation were increased in VPS13A knockdown 3T3L1 cells.Conclusion：VPS13Aexpression is modulated by cell differentiation status in 3T3L1 cells.Knockdown of VPS13A enhances the differentiation of 3T3L1cells.Key words VPS13A；3T3L1 cell；lipid droplets；adipocytes differentiationJ Nanjing Med Univ，2023，43（08）：10411046基金项目国家自然科学基金（32130050，3220110126）；南京医科大学科技发展基金（2016NJMU004）通信作者（Correspondingauthor），Email：基础研究南京医科大学学报（自然科学版）Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences）第43卷第8期2023年8月1041南京医科大学学报第43卷第8期2023年8月点4。囊泡分选蛋白13（vacuolar protein sorting 13，VPS13）是新鉴定出来的脂质转运蛋白，其在进化上相对保守。该蛋白首先在酵母中被发现，但在人类中有 4 种与其同源的基因（VPS13AD）5。VPS13 基因的突变与遗传性疾病具有密切关系：VPS13A 被报道与舞蹈棘细胞增多症密切相关；VPS13B突变可导致科恩综合征，该疾病的特征是整体发育迟缓和智力残疾；VPS13C则与早发型的帕金森病相关；VPS13D突变会伴有痉挛状态的共济失调。因此研究VPS13的亚细胞定位及其分子功能将有助于揭示这些疾病的发病机制。研究表明，VPS13A定位于内质网线粒体和内质网脂滴接触部位 6，是内质网和其他细胞器之间的脂质转运蛋白 7。VPS13A敲降后人胚肺细胞内的脂滴增多 8，目前关于VPS13A在脂肪细胞中的作用还没有相关研究报道，本研究旨在观察VPS13A在3T3L1细胞分化过程中的表达情况以及敲降VPS13A对脂肪前体细胞3T3L1分化和脂代谢的影响。1材料和方法1.1材料3T3L1 细胞由南京医科大学韩晓教授惠赠；VPS13A抗体（武汉爱博泰克公司）；过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activatedreceptorg，PPAR）抗体、转录共激活因子CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/Enhancer binding protein alpha，C/EBP）抗体、转录共激活因子CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/Enhancer binding protein，C/EBP）抗体（Santa Cruz 公司，美国）；Calnexin 抗体（Stressgen 公司，加拿大）；蛋白 marker（BioRad 公司，美国）；油酸、油红（SigmaAldrich公司，美国）；TRIzol Reagent总RNA提取剂、胰岛素（Invitrogen公司，美国）；3异丁基1甲基黄嘌呤、地塞米松、罗格列酮（MCE 公司，美国）；SYBR Green （SYBR GreenqPCR Master Mix）（南京诺唯赞）；胎牛血清、小牛血清（Gibco公司，美国）；3.5 cm皿和6孔板（Corning公司，美国）；引物由上海捷瑞基因有限公司合成；氟硼二吡咯化合物（4，4difluoroboradiazaindacene，BODIPY）、逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit（Thermo Fisher公司，美国）。1.2方法1.2.13T3L1细胞培养、分化3T3L1细胞置于高糖培养基（含10%小牛血清）中于37、5%CO2培养箱中培养，隔天需更换新鲜培养基。待3T3L1细胞生长密度达到80%90%后，将细胞传代到 3.5 cm 细胞培养皿中，继续在培养箱（37、5%CO2）中培养，待细胞生长密度达到100%，继续让细胞接触抑制2 d，于第3 天更换新的分化培养液（含0.5 mmol/L 3异丁基1甲基黄嘌呤、5.0mol/L地塞米松、1.0mol/L罗格列酮、1.0g/L胰岛素和10%胎牛血清），在分化液中分化2 d，再换上分化培养液（含1 g/L胰岛素和10%胎牛血清）继续在分化培养液中分化6 d，隔天换新鲜的高糖培养基。1.2.2慢病毒感染和单克隆细胞筛选将HEK293T细胞于6 cm培养皿中培养，等细胞密度达到70%80%时，用lipofectamine2000将三质粒（lentiCRISPRv2、psPAX2、pMD2.G）共同转染进人胚胎 肾细胞 293（human embryonic kidney 293cells，HEK293T）细胞进行病毒的包装，小向导核糖核酸（small guide ribonucleic acid，sgRNA），sgRNAVPS13A oligo 的序列为：sgRNAVPS13A 上游引物5CACCGTGACCAACTTTAACTTTGAA3，下游引物5AAACTTCAAAGTTAAAGTTGGTCAC3，转染6 h后给细胞换液，分别收集48 h和72 h含慢病毒的培养基。4 500 g离心20 min取上清，0.22 m滤器过滤，分装后放-80 保存。感染病毒前一晚将3T3L1接种到6孔板（感染前密度达到50%左右），将病毒上清与培养基于EP管1 1混匀，并加入Polybrene（终浓度：8mg/mL），缓慢加入孔板中。预先留2个未感染病毒的孔作为空白对照。感染24 h后换液，感染48 h后，换含有2 g/mL嘌呤霉素的培养基进行筛选。3 d后，观察空白对照组细胞基本死亡，继续培养实验组细胞，Western blot验证敲降效率。单克隆细胞筛选：细胞计数，将细胞以每孔1个细胞的密度种到96孔板中，细胞贴壁后镜下观察单个细胞的孔，并做标记。96孔板中单个细胞长成细胞团后，胰酶消化后接种到24孔板。以此类推，细胞长满后依次种到12孔板、6孔板，Western blot验证敲降效率。1.2.3RNA提取及相对定量水平检测3.5 cm细胞培养皿中加入0.5 mL TRIzol将细胞裂解，将红色液体转移到新的EP管中。在裂解液中加入200 L氯仿，轻微涡旋15 s，22 静置5 min，将其于4 12 000 g 离心 30 min，分离水相层；再将上层含RNA的液体转移到新的离心管，再加入500 L预冷的异丙醇沉淀RNA，轻轻混匀，22 静置15 min。在4 离心机中10 000 g离心15 min，保1042留底部的白色沉淀，将上层液体弃去，用RNA专用的75%乙醇洗涤沉淀，再次在4 离心机中10 000 g离心5 min，使RNA重新沉淀，将乙醇弃去，待RNA自然风干。用含有焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）的 ddH2O 溶解。使用 NanaDrop 仪器测量RNA的浓度。利用两步法，将RNA