SOX1过表达抑制食管癌细胞的增殖并促进凋亡的发生.pdf

基金项目:河南省自然科学基金(222300420537)第一作者简介:晋大川,研究方向:食管癌相关分子机制研究。E-mail:jindcvip 通讯作者:周舫,博士,教授,研究方向:职业肿瘤与应激医学。E-mail:zhoufang doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.08.011SOX1 过表达抑制食管癌细胞的增殖并促进凋亡的发生晋大川1,郭军强2,岳欣3,程金兵4,周蓉1,靳超美1,焦琳琳1,周舫11.郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室,河南 郑州 450001;2.新乡医学院药学院;3.河南省直第三人民医院检验科;4.濮阳县人民医院外科【摘要】目的探索 SOX1 过表达对食管癌细胞增殖及凋亡的作用及其机制。方法构建 SOX1 过表达细胞株,检测 SOX1 mRNA 和蛋白表达,CCK-8 检测细胞增殖,细胞划痕及结晶紫染色检测细胞的迁移及克隆形成能力,Hochest 染色实验检测细胞凋亡情况,Western blotting 检测 GSK-3 及 Wnt/-catenin 通路相关蛋白表达水平。结果SOX1 过表达组 mRNA 显著高于对照组(P0.01)。CCK-8 OD 值及增殖曲线绘制表明 SOX1 过表达组增殖速率显著降低(P0.05);SOX1 过表达组细胞的迁移速率和克隆形成能力明显下降(P0.05);显微镜下观察到 SOX1 过表达组细胞的皱缩明显,提示凋亡的发生;Western blotting 检测结果表明,SOX1 过表达组 GSK-3 上调,Wnt 信号通路相关基因-catenin、Cyclin D1、c-Myc 蛋白表达明显下降(P0.05)。结论SOX1 通过抑制 Wnt/-catenin 信号传导抑制食管癌细胞的增殖和促进凋亡。【关键词】食管癌;SOX1;细胞迁移;细胞凋亡;Wnt/-catenin中图分类号:R735.1文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)08-0891-05收稿日期:2022-09-13SOX1 overexpression inhibits proliferation and promotes apoptosis of esophageal carcinoma cellsJIN Dachuan1,GUO Junqiang2,YUE Xin3,CHENG Jinbing4,ZHOU Rong1,JIN Chaomei1,JIAO Linlin1,ZHOU Fang11.Department of Occupational Health and Occupational Disease,College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;2.School of Pharmacy,Xinxiang Medical University;3.Department of Clinical Laboratory,the Third Peoples Hospital of Henan Province;4.Department of Surgery,Puyang County Peoples Hospital,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of SOX1 overexpression on proliferation and apoptosis of esophageal carcinoma cells.MethodsSOX1 was overexpressed in ECA109 and EC9706.SOX1 mRNA and protein expression were detected.Cell proliferation was detected by CCK-8.Cell migration and clonal formation ability were de-tected by crystal violet staining,and cell apoptosis was detected by Hochest staining.Western blotting was performed to analysis GSK-3 and Wnt/-catenin pathway.ResultsmRNA in SOX1 overexpressed group was significantly higher than that in control group(P0.01).CCK-8 showed that the proliferation rate of SOX1 overexpressed group was signifi-cantly decreased(P0.05).The migration rate and clonal formation ability of SOX1 overexpressed cells decreased sig-nificantly(P0.05).Under the microscope,the cells in SOX1 overexpressed group showed obvious shrinkage,sugges-ting the occurrence of apoptosis.Western blotting analysis showed that GSK-3 was up-regulated in SOX1 overexpressed group,and-catenin,Cyclin D1,c-Myc protein expression of Wnt signaling pathway was significantly decreased(P0.05).ConclusionSOX1 inhibits esophageal carcinoma cells proliferation and promotes apoptosis by inhibiting Wnt/-catenin signaling.【Key words】Esophageal carcinoma;SOX1;Cell proliferation;Apoptosis;Wnt/-catenin食管癌作为一种侵袭性疾病,是全球最常见的癌症之一1。食管癌的发生与长期摄入的食物中含有亚硝铵类化合物、不良饮食习惯(食物过烫、粗糙或变霉等)、不良生活习惯(熬夜、吸烟、喝酒)有很大关系。其发病率在经济不发达地区较高,且在发病后期无能显著提高患者生存质量的有效措施2-3,SOX 基因属SRY BOX 基 因 超 家 族。SOX1、SOX2、SOX3、SOX7、SOX9 和 SOX17 已被证明是不同类型癌症中的抑制因子4-5。GSK-3 是多种信号转导通路中的关键激酶之一,主要参与慢性炎症的调控,并与多种肿瘤的发生发展密切相关。SOX 家族成员通过操纵 Wnt 信号来发挥其功能是一种相当常见的策略。Wnt 信号的异常激活与 人类致癌 相 关-catenin 破 坏 复 合 物(APC、Axin2、CK1 和 GSK-3)的突变或失调导致 Wnt 信号的激活6。本研究拟分析 SOX1 过表达对食管癌细胞198胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8增殖、迁移、凋亡及 Wnt/-catenin 信号通路的影响,探索 SOX1 对于食管癌的潜在治疗价值。1材料与方法1.1实验材料食管癌 ECA109、EC9706 细胞系(中国科学院细胞库);RPMI-1640 培养基(河南普诺易生物制品研究院有限公司);胎牛血清(美国 Gibco 公司);胰酶、青链霉素(河南普诺易生物制品研究院有限公司);SOX1 过表达载体由吉凯基因有限公司合成。结晶紫染色液(上海碧云天生物技术有限公司);Hochest 33342(上海碧云天生物技术有限公司);Lipofectamine 3000(美 国 Invitrogen 公 司);SOX1、Cyclin D1、-catenin、c-Myc、GSK-3、-actin 抗体均购自 CST 公司。1.2方法1.2.1细胞转染:取对数生长期 ECA109、EC9706 细胞株接种到 12 孔板中,待细胞融合度为 70%左右时,将 SOX1 阴性或 SOX1 过表达载体转染到两种细胞中,实验步骤参照脂质体转染试剂 Lipofectamine 3000 使用说明,质粒 Lipofectamine 3000=1 2.5;转染 8 h 后更换新鲜培养基。1.2.2qRT-PCR:qRT-PCR 检测过表达后 SOX1 的 mRNA表达水平。引物:SOX1-F:5-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3,SOX1-R:5-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3;GAPDH-F:5-GACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3,GAPDH-R:5-ATG-GCATGGACTGTGGTCATGAG-3。使用细胞总 RNA 分离试剂盒(FOREGENE,中国成都)从 ECA109、EC9706细胞中获得总 RNA。NovoScriptSYBR 两步 qRT-PCR SuperMix(Novoprotein,中 国)用 于 将 RNA 逆 转 录 为cDNA。最终体积为 10 l 的 qRT-PCR 反应混合物为0.4 l 模板 cDNA、5 l LBR 预混料 Ex Taq、0.3 l 正向引物、0.3 l 反向引物和 4 l ddH2O。反应是在皮科雷尔号上进行的 96 实时 PCR 系统(ThermoFisher Scientific,美国),使用 PikoReal 软件 2.2。扩增条件如下:95 5 min,94 30 s,40 个周期,50 30 s,72 40 s,60 60 s。通过 2-Ct方法计算相对 mRNA表达。进行了 3 个平行实验。1.2.3CCK-8 实验:将对照组(阳性对照与阴性对照)和SOX1 过表达细胞分别以 2103个/ml 的浓度接种于 96孔板(100 l/孔)中,置于37,体积分数为 5%的 CO2中培养。CCK-8 试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)分别在 12、24、48、72 h 检测细胞活力,持续 5 d。细胞达到90%融合后,向每孔添加10 l CCK-8 溶液,在培养箱中培养 2 h 后,在微孔板读取器下测量 450 nm 处的吸光度(OD)值。对每种类型的细胞进行一式三份的分析。1.2.4细胞迁移及克隆形成实验:(1)通过划痕实验比较 SOX1 过表达后对于细胞迁移能力的影响。细胞接种于 6 孔板(1105个细胞/孔)中培养 24 h,融合度为 95%左右。划痕实验通过在融合的单层上用移液管尖端造成的线性划痕进行。伤后 0、12、24、48 h,立即在光学显微镜下(Eclipse Ti-S;日本东京尼康公司)记录在不含 FBS 的培养基中培养的细胞图像。测量伤口间隙的宽度,并将线性划痕 0 h 作为标准,用于 3个独立实验。(2)用阴性对照载体转染 ECA109 和EC9706 细胞 48 h 后进行集落形成实验。然后将转染细胞以 200 个/孔的密度接种到 24 孔培养板中,并在体积分 数 为 5%的 CO2增 湿 培 养 箱 中 于 37 的DMEM 中常规培养。细胞保持 14 d,在 25 下,用 Gi-emsa(北京索拉比科技有限公司,中国北京)对细胞进行 15 min 染色,以评估细胞克隆的形成。菌落形成效率根据光学显微镜下计数的菌落数计算(放大 100倍)。每组选择 5 个视野。1.2.5Hoechst 染色:通过 H