PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参.pdf

PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参研究报告D0I:10.13995/ki.11-1802/ts.035709引用格式：刘墨祎，汪香君，汪洺卉，等.PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参J.食品与发酵工业，2 0 2 3，49（17）：6 9-74.LIU Moyi,WANG Xiangjun,WANG Minghui,et al.Visual discrimination of Panax ginseng and Panax quinquefolium byPCR and G-quadruplex J.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):69-74.刘墨祎，汪香君，汪洺卉，李迎,刘丽梅*（北华大学医学技术学院，吉林吉林，132 0 13）摘要人参和西洋参作为我国常用名贵中药，其价值很高，由于它们为人参属近缘物种，因此二者在形态和化学成分方面较为相似。然而人参和西洋参的药性和药效有较大区别，二者在临床上不可混用，所以对二者进行鉴定就尤为重要。该研究基于人参与西洋参基因组DNA上的特异性snp位点，设计了5 端含有G-四链体互补序列的上下游引物，通过PCR扩增出大量含G-四链体的双链DNA，与氯高铁血红素（Hemin）结合形成具有过氧化物酶活性的DNA酶（DNAzyme），并在H,O，存在的情况下催化ABTS发生颜色变化。通过对PCR体系以及显色体系的优化，达到快速、简便地鉴别人参与西洋参，灵敏度可达到0.1ng/uL。研究建立了针对人参和西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法，为人参与西洋参的鉴别提供了新的途径。关键词PCR；G-四链体；人参；西洋参；可视化鉴别人参和西洋参均为五加科人参属的草本植物,其根、茎等部位均可入药，药用价值极高1-2 。由于人参和西洋参为人参属近缘物种，两者形态和化学成分较为相似,因此市场上将两者掺杂混用现象时有发生3。但人参与西洋参在药性和药效上存在较大差异：人参性温，补气助阳，适合体质为寒性的人服用；而西洋参性?，易于补气养阴，适合阴虚体质或者燥热的人服用4-6 ,两者在临床上不可混用。目前国内外对人参和西洋参的检测方法包括形态学、化学分析法和分子生物法7-8 ，但都易受到外部环境条件、加工过程和人为主观因素的影响。因此，急需建立一种简单高效的人参和西洋参鉴别方法。G-四链体（G-quadruplex)是由富含鸟嘌呤（G）的DNA或RNA序列形成的一类独特的核酸结构9-10 G-四链体有3种不同的拓扑结构，分别为平行式、反平式和混合式。CHENG等12 研究发现，不同的结构下G-四链体的稳定性不同，且与氯高铁血红素结合能力也不同13。稳定的G-四链体结构可在K*作用下与氯高铁血红素（Hemin)结合,形成具有类似辣根过氧化物酶活性的模拟酶（DNAzyme）,在H,O,存在的条件下催化ABTS由无色变为绿色4。根据这一原理已实现对金属离子15-17 、核酸及蛋白等小分子物质18-19 的检测。G-四链体形成的具有氧化酶活性的模拟酶（DNAzyme）与酶相比,具有热稳第一作者：硕士研究生（刘丽梅副教授为通信作者，E-mail：l i u l m 7 4 16 3.c o m）基金项目：吉林省科技发展计划项目（2 0 19 0 30 410 8 YY）；吉林省科技发展计划项目（YDZJ202201ZYTS515）收稿日期：2 0 2 3-0 4-0 3，改回日期：2 0 2 3-0 5-0 3定性、高催化效率、易于制备和修饰等特点2 0 。本实验将PCR技术与G-四链体功能特点结合，以人参与西洋参基因组DNA上的特异性 snp位点,设计了5 端含有G-四链体互补序列的上下游引物，通过PCR扩增目标序列，获得大量含G-四链体的双链DNA,并形成G-四链体结构的DNAzyme,建立了针对人参和西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法。1材料与方法1.1材料与试剂本研究中的人参和西洋参样品均由国家参茸检验检测中心提供；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成;PremixTaqTM，宝生物工程（大连）有限公司；ABTS、氯高铁血红素（Hemin），上海源叶生物科技有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司;PCR产物纯化回收试剂盒，北京博迈德基因技术有限公司。1.2仪器与设备LX-100手掌型离心机，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ETC811型基因扩增仪,苏州东胜兴业科学仪器有限公司；梯度电泳分析仪、酶标仪，Bio-Rad公司；凝胶成像分析仪，德国耶拿公司;DNA/蛋白质分析仪，Quawell公司。2023 年第49 卷第17 期(总第48 5期)69食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES1.3实验方法1.3.1基因组 DNA的提取用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA,DNA浓度通过DNA分析仪检测获得。1.3.2引物设计在NCBI上查找人参和西洋参的基因组序列,利用DNAMAN进行多序列比对。发现人参和西洋参在18S基因上存在snp位点，依据snp位点设计出用于特异性识别和扩增人参基因组序列的上下游引物。上游引物序列为：5-ATAACAATACCGGGCTGATAC-3；下游引物序列为：5-GCCAGTTAAGGACAGGAG-3,并在引物的5 端加上一段G-四链体的反向互补序列，修饰后的上游引物序列为：5-CCCACCCAC-CCACCCATAACAATACCGGGCTGATAC-3;修饰后的下游引物序列为：5-CCCACCCACCCACCCGCCAGT-TAAGGACAGGAG-3,其中 5-CCCACCCACCCACCC-3为G-四链体序列（G3T)3G3的反向互补,在K+的存在下可形成平行的G-四链体结构，且稳定性好，可视化反应结果明显2 1。1.3.3PCR反应体系和条件的优化以人参和西洋参的基因组DNA为模版进行PCR反应体系和条件的优化。首先在无模版的体系下进行PCR,检测1、2、3、4、5、6、8、10 mol/L引物浓度下引物二聚体的形成对G-四链体显色反应的影响；然后进行引物浓度与模版浓度之间的优化，引物浓度梯度设置为2、4.6、10 mol/L，模版浓度梯度为0.0 0 1、0.01、0.1、1、10 n g/L;最后确定最适的PCR退火温度，退火温度梯度设置为54、58、6 2、6 6、7 0。最终对比PCR和显色结果确定反应体系：10 LPremix Taq.DNA聚合酶,4 L DNA(10 ng/L)模版,1L上下游引物（10 mol/L），加双蒸水至20L。PC R 扩增条件:9 5预变性5min,95变性2 5s,54退火2 5s,72延伸2 5s,72延伸5min,30个循环。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳（12 0 V,40min）进行鉴定,利用凝胶成像系统对结果进行观察分析。1.3.4可视化反应体系的优化将用DNA纯化回收试剂盒回收得到的PCR产物加人2 0 L结合缓冲液（2 5mmol/LHEPESpH7.4、2 0 m m o l/L K C l、2 0 0 m m o l/L Na C l、质量分数0.05%TritonX-100、体积分数1%的DMSO与2 L不同终点浓度Hemin溶液充分混匀，终浓度梯度为0.005、0.0 1、0.1、0.5、1m m o l/L。9 5孵育5min完702023 Vol.49 No.17(Total 485)成G-四链体的折叠。之后4孵育8 min,使G-四链体与Hemin充分结合。加人2 0 L不同终点浓度的ABTS,终浓度梯度为3、10、30、45、6 0 mmol/L，以及2LH,0,（3%）室温避光反应至变色，酶标仪测定420nm处的吸光度值，选择最优的可视化结果进行后续的实验。1.3.5特异性检测为验证特异性，分别对4组人参样品和4组西洋参样品的基因组DNA进行提取。按照优化后的反应条件和最适体系进行PCR扩增与G-四链体联用可视化检测，测定42 0 nm处的吸光值，验证本实验方法的特异性。1.3.6灵敏度检测将提取的人参基因组DNA进行稀释,浓度梯度为：0.0 0 1、0.0 1、0.1、1、10 ng/uL，根据已优化好的反应条件和最适体系进行PCR扩增与G-四链体联用可视化检测，测定42 0 nm处的吸光值，以检测本实验方法的灵敏度。1.4数据处理数据处理采用Excel,柱状图和折线图的绘制采用GraphPad Prism8,并采用Adobe Photoshop软件对图片进行组合排列。每组实验数据进行3次重复。2结果与分析2.1PCR反应体系以及条件的优化2.1.1无模版情况下引物浓度对可视化显色效果的影响和普通PCR引物不同，本实验在PCR上下游引物的5 端加人了G-四链体反向互补序列进行修饰，这样可能会导致引物二聚体更易形成，并干扰实验结果。为了排除这一干扰因素,将引物稀释为1、2、3、4、5、6、8、10 mol/L的梯度浓度,对其进行G-四链体与PCR联用可视化检测。由图1-a可知,在不同引物浓度下,无模版的PCR体系在扩增后未产生目的条带，且引物浓度与引物二聚体的增加成正比；由图1-b可知，引物浓度对显色反应无明显影响，且在420nm下吸光度值之间无明显差异。因此，无模版情况下引物浓度对G-四链体与PCR联用可视化显色效果没有明显影响。2.1.2PCR体系中引物浓度对模版DNA浓度的优化根据PCR扩增的原理，在模版浓度不变时，引物浓度增加会导致PCR产物的增加,反之亦然。所以找到最适的引物浓度与其相对应的最适模版浓度对PCR反应的优化尤为重要。从图2 可以看出，当引物浓度研究报告abpM123456782000180038250100b0.15-0.10o0.05-0a-PCR产物凝胶电泳图;b-G-四链体可视化检测显色效果和42 0 nm处吸光值图1无模版PCR体系里引物浓度对G-四链体显色反应的影响Fig.1 Effect of primer concentrations in a PCR reactionsystem without templates on the G-quadruplex注：M-Marker DL2000;1 8分别为1、2.3、4、5.6、8、10 mol/L。为10 mol/L时，可检测出最低浓度为0.1ng/L的模版，因此选择引物浓度为10 mol/L作为后续实验的引物浓度。且在此引物浓度下，模版浓度为10ng/L时,电泳图的目的条带最为明显,所以选择模版浓度为10 ng/L进行后续的实验。bpM1 2345 6M1 2345 62000588250100aM123456M 123456Cda-2mol/L;b-4mol/L;c-6 mol/L;d-10 mol/L图2 PCR反应体系中引物浓度与模版浓度之间的优化Fig.2 Optimization of the ratio of primer totemplate in a PCR reaction system注：M-MarkerDL2000;1-阴性对照;2 6 为0.0 0 1、0.0 1、0.1、1、10 ng/L2.1.3PCR反应退火温度的优化退火温度也是PCR反应中重要的影响因素,退火温度的高低会影响PCR产物的产生，找到最适合反应体系的退火温度至关重要。在以上优化条件的基础上将退火温度梯度设置为54、58、6 2、6 6、7 0，观察反应结果。图3为退火温度为54、58、6 2、6 6、70下PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，可见退火温度为54时，条带最明显，因此选择退火温度为54进行后续实验。bpM12345678910112.00010007505003456812colorings reaction10引物浓度/(mol/L)b250100Fig.3Optimization of PCR reaction anneal