朝藿定B对BV2小胶质细胞炎症反应的作用及机制.pdf

第5 9卷 第3期2 0 2 3年0 6月青 岛 大 学 学 报(医 学 版)J OUR NA LO FQ I N G D AOUN I V E R S I T Y(ME D I C A LS C I E N C E S)V o l.5 9,N o.3J u n e 2 0 2 3 收稿日期2 0 2 2-1 2-1 0;修订日期2 0 2 3-0 6-1 2 基金项目国家自然科学基金资助项目(3 1 8 7 1 1 4 4)第一作者胡子凡(1 9 9 7-),男,硕士研究生。通信作者陈文芳(1 9 6 8-),女,博士,教授,博士生导师。E-m a i l:c h e n w e n f a n g q d 1 6 3.c o m。朝藿定B对B V 2小胶质细胞炎症反应的作用及机制胡子凡,谷雨,范育辰,戴玮,陈文芳(青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 2 6 6 0 7 1)摘要 目的 探讨朝藿定B对脂多糖(L P S)诱导的B V 2小胶质细胞炎症反应的抑制作用及雌激素受体(E R)特异性阻断剂I C I 1 8 2,7 8 0的阻断效应。方法 常规培养B V 2小胶质细胞,加或不加朝藿定B、L P S、I C I 1 8 2,7 8 0处理,采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5二苯基溴化四唑(MT T)比色法检测细胞活力,实时聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子-(TNF-)和白细胞介素-6(I L-6)mR NA的表达。结果 不同浓度朝藿定B对B V 2小胶质细胞活力没有影响(P0.0 5)。L P S可明显上调促炎因子TNF-(F=1 0.6 4,q=9.1 5 7,P0.0 0 1)和I L-6(F=2 5.2 5,q=1 2.6 3 0,P0.0 0 1)mR NA的表达;1、1 0m o l/L朝藿定B预处理均能明显抑制L P S诱导的TNF-mR NA表达上调(q=4.6 5 5、5.4 0 8,P0.0 5),1 0m o l/L朝藿定B对L P S诱导的I L-6mR NA表达有明显的抑制作用(q=4.6 9 6,P0.0 5)。朝藿定B对L P S诱导的TNF-和I L-6mR NA表达的抑制作用可被I C I1 8 2,7 8 0所阻断(F=1 2.5 3、2 8.7 1,q=5.3 1 8、4.6 8 4,P0.0 5).L P Ss i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e dt h emR NAe x p r e s s i o nl e v e l so ft h ep r o i n f l a mm a t o r yf a c t o r sTNF-(F=1 0.6 4,q=9.1 5 7,P0.0 0 1)a n dI L-6(F=2 5.2 5,q=1 2.6 3 0,P0.0 0 1).E p i m e d i nBp r e t r e a t m e n ta tc o n c e n t r a t i o n so f1a n d1 0m o l/Ls i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e dt h eu p r e g u l a t e dmR NAe x p r e s s i o no fTNF-i n d u c e db yL P S(q=4.6 5 5,5.4 0 8;P0.0 5),a n dE p i m e d i nBa t ac o n c e n t r a t i o no f 1 0m o l/Ls i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h eL P S-i n d u c e dmR NAe x p r e s s i o no fI L-6(q=4.6 9 6,P0.0 5).T h e i n h i b i t o r ye f f e c to fE p i m e d i nBo n t h eL P S-i n d u c e dmR NAe x p r e s s i o no fTNF-a n dI L-6c o u l db eb l o c k e db y I C I 1 8 2,7 8 0(F=1 2.5 3,2 8.7 1;q=5.3 1 8,4.6 8 4;P0.0 5).C o n c l u s i o n E p i m e d i nBc a n i n h i b i t t h e e x p r e s s i o no f p r o i n f l a mm a t o r y f a c t o r si n d u c e db yL P S i nB V 2m i c r o g l i a l c e l l s,w h i c hm a yb ea s s o c i a t e dw i t ht h eE Rs i g n a l i n gp a t h w a y.K E Y WO R D S E p i m e d i nB;l i p o p o l y s a c c h a r i d e s;i n f l a mm a t i o n;r e c e p t o r s,e s t r o g e n;m i c r o g l i a 神经炎症是一种复杂的先天免疫反应,能够对病原体、受损细胞和中枢神经系统刺激物等有害刺激做出反应1,在中枢神经系统疾病发病中发挥着重要的作用,是神经退行性疾病发病的主要驱动因素2-4。在各种致炎因子的刺激下,与神经炎症相关的小胶质细胞被过度激活,释放促炎因子,诱导神经元损伤,使炎症反应加剧,进而加速某些神经退行性疾病的进程5-7。因此,有效抑制小胶质细胞的炎症反应是治疗中枢神经系统炎症的有益思路。淫羊藿作为传统中药,具有补肾壮骨、抗癌、抗抑郁、改善学习记忆等多种功效8-1 0。朝藿定B是淫羊藿总黄酮主要的活性成分,具有低毒的优势1 1-1 2。研究表明,朝藿定B具有调节炎症和骨保护等作用,其机制可能与雌激素受体(E R)有关1 3-1 4。但在神经系统,朝藿定B是否具有抗炎神经保护作用尚未见报道。本研究应用脂多糖(L P S)制备B V 2小胶质细胞炎症 3 3 4青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷模型,探讨朝藿定B对L P S诱导的B V 2小胶质细胞炎症反应的作用及其可能机制。现将实验结果报告如下。1 材料和方法1.1 主要材料B V 2小胶质细胞属于小鼠小胶质瘤细胞系,购自北京市协和医学院细胞资源中心;朝藿定B购自上海同田生物技术有限公司;L P S和I C I1 8 2,7 8 0购自美国S i g m a公司;DMEM高糖培养液购自B I公司;青霉素/链霉素储存液购自新华制药厂,分装后-2 0保存备用;胎牛血清购自B I公司,分装后-4 0保存备用;3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5二苯基溴化四唑(MT T)购自国风生物公司,应用浓度为0.0 1m o l/L的P B S溶解,配制成5g/L的母液;T R I z o l试剂购自美国L i f eT e c h n o l o g i e s公司;聚合酶链反应(P C R)逆转录试剂盒购自美国T a K a R a公司;S Y B RG r e e n(M a s t e rM i x)购自诺维赞医疗科技有限公司;P C R引物由青岛蔚来生物科技有限公司设计并合成。1.2 细胞培养及分组B V 2小胶质细胞接种于培养瓶或孔板中,应用DMEM高糖培养液(内含体积分数0.0 1的青链霉素和体积分数0.1 0的胎牛血清),置于无菌培养箱(含体积分数0.0 5C O2、3 7)中常规培养。为观察不同浓度朝藿定B对细胞活力的影响,实验分为对照组、不同浓度(1、1 0、2 0m o l/L)朝藿定B组、L P S(1g/L)与不同浓度朝藿定B合用组。为观察不同浓度朝藿定B对L P S诱导的肿瘤坏死因子-(TNF-)和白细胞介素-6(I L-6)mR NA表达的影响,实验分为对照组(A组)、L P S组(B组)、1m o l/L朝藿定B+L P S组(C组)、1 0m o l/L朝藿定B+L P S组(D组)和2 0m o l/L朝藿定B+L P S组(E组)。为验证I C I1 8 2,7 8 0是否能阻断朝藿定B对L P S诱导的TNF-和I L-6mR NA表达的作用,实验分为对照组(a组)、L P S组(b组)、朝藿定B+L P S组(c组)和I C I 1 8 2,7 8 0+朝藿定B+L P S组(d组)。1.3 MT T法检测细胞活力对B V 2小胶质细胞悬液进行计数,调整细胞的密度为81 07/L,随后将细胞悬液均匀接种在9 6孔板中,每孔1 0 0L,置于含体积分数0.0 5C O2、3 7培养箱中培养2 4h。培养至细胞融合度达到7 0%时,按照分组加入药物处理2 4h。弃去细胞培养液,每孔加入5g/L浓度的MT T溶液2 0L,继续避光培养4h。吸去上清液,每孔加1 0 0L二甲基亚砜,使甲瓒晶体溶解。在低速摇床(8 09 0r/m i n)上避光振荡1 0m i n。最后用酶标仪在4 9 0n m波长下检测各孔吸光度(A)值。1.4 实时聚合酶链反应(r e a l-t i m eP C R)方法检测TNF-和I L-6mR NA的表达在显微镜下观察1 2孔板中的细胞融合度,达8 0%9 0%时按分组进行加药处理。收集细胞,应用T R I z o l法提取细胞总R NA,按照T a K a R a试剂盒说明书配制两步法反应体系,将R NA逆转录为c D NA。配制2 0.0L的P C R反应体系,包括M a s-t e rM i x1 0.0L、R N a s ef r e ew a t e r8.2L、上下游引物各0.4L以及c D NA1.0L。将此反应体系放入r e a l-t i m eP C R仪中进行扩增。经4 0个循环完成扩增,采用2-C T法计算目的基因I L-6、TNF-的相对表达量(以G A P DH为内参基因)。P C R扩增引物及其序列见表1。表1 P C R引物及其序列引物名称位置 引物序列(5 3)I L-6上游AA C GA T GA T G C A C T T G C A GA下游GAA C G T C A C A C A C C AG C AG G T T ATNF-上游T AT G G C C C A GA C C C T C A C A下游G GA G T A GA C AA G G T A C AA C C C AT CG A P DH上游T G T G T C C G T C G T G GA T C T GA下游T T G C T G T T GAA G T C G C A G GA G1.5 统计学处理应用G r a p hP a dP r i s m8.0软件进行统计学处理。所得结果以xs形式表示,多组比较采用单因素方差分析(O n e-W a yANOVA),继以T u r k e y法进行组间两两比较。以P0.0 5),3期胡子凡,等.朝藿定B对B V 2小胶质细胞炎症反应的作用及机制3 3 5表明实验所选的用药浓度对B V 2小胶质细胞没有毒性。2.2 不同浓度朝藿定B对L P S诱导的TNF-和I L-6mR NA表达的影响r e a l-t i m eP C R检测结果显示,与对照组相比,L P S组B V 2小胶质细胞中TNF-和I L-6mR NA表达水平显著升高(F=1 0.6 4、2 5.2 5,q=9.1 5 7、1 2.6 3 0,P0.0 0 1);1、1 0m o l/L朝藿定B预处理均能明显抑制L P S诱导的TNF-mR NA表达上调(q=4.6 5 5、5.4 0 8,P0.0 5),1 0m o l/L