HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立及在筛选天然有效多糖中的应用.pdf

第40卷第4期2023年7月新疆大学学报（自然科学版）（中英文）Journal of Xinjiang University(Natural Science Edition in Chinese and English)Vol.40,No.4Jul.,2023HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立及在筛选天然有效多糖中的应用姜 慰1，史 茜2，刘晓颖1，付玉兰1，李金耀1，王为兰1(1.新疆大学 生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830017；2.新疆生产建设兵团医院 检验科，新疆 乌鲁木齐 830063)摘要：探讨高糖、地塞米松、胰岛素诱导肝细胞HepG2胰岛素抵抗模型（IR-HepG2）的建立方法，检测杏鲍菇多糖、红枣多糖和枸杞多糖体外改善肝细胞胰岛素抵抗的作用，评估3种多糖的降糖效果 选择不同浓度的地塞米松、胰岛素及两者联合作用，在高糖培养条件下诱导HepG2胰岛素抵抗，MTT法检测不同诱导剂对HepG2细胞活性的影响，葡萄糖氧化酶法测定细胞葡萄糖消耗量，同时检测去除诱导剂后，IR-HepG2细胞模型的稳定性 以3种天然多糖处理IR-HepG2细胞，检测其对细胞活力及胰岛素抵抗的影响 结果表明：在高糖培养条件下，诱导剂为地塞米松（3.75 mol/L）联合胰岛素（0.001 mol/L）可成功诱导IR-HepG2细胞模型，且对细胞活性无显著影响，模型能够在72 h内保持稳定 枸杞多糖具有更好的降糖效果关键词：胰岛素抵抗；HepG2细胞；杏鲍菇多糖；红枣多糖；枸杞多糖DOI：10.13568/ki.651094.651316.2022.12.22.0001中图分类号：TS201.4文献标识码：A文章编号：2096-7675(2023)04-0461-06引文格式：姜慰,史茜,刘晓颖,付玉兰,李金耀,王为兰.HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立及在筛选天然有效多糖中的应用J.新疆大学学报(自然科学版)(中英文),2023,40(4):461-466.英文引文格式：JIANG Wei,SHI Qian,LIU Xiaoying,FU Yulan,LI Jinyao,WANG Weilan.Establishment ofinsulin resistance model of HepG2 cells and application in selection of active natural polysaccharidesJ.Journal ofXinjiang University(Natural Science Edition in Chinese and English),2023,40(4):461-466.Establishment of Insulin Resistance Model of HepG2 Cells andApplication in Selection of Active Natural PolysaccharidesJIANG Wei1,SHI Qian2,LIU Xiaoying1,FU Yulan1,LI Jinyao1,WANG Weilan1(1.Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,School of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi Xinjiang 830017,China;2.Department of Clinical Laboratory,Hospital of XinjiangProduction and Construction Corps,Urumqi Xinjiang 830063,China)Abstract：To explore the establishment of insulin resistance model of HepG2(IR-HepG2)induced by high glucose,dexamethasone and insulin,to detect the effect of Pleurotus eryngii polysaccharides,Ziziphus jujuba polysaccharidesand Lycium barbarum polysaccharides on improving insulin resistance of liver cells in vitro,and to analyze the effectof three polysaccharides on hypoglycemic.Different concentrations of dexamethasone,insulin and their combinationwere selected to induce the insulin resistance of HepG2 cells in high glucose culture.MTT method was used todetect the effect of different inducers on the activity of HepG2 cells.Glucose oxidase method was used to detect收稿日期：2022-12-22基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学青年基金“肉苁蓉苯乙醇苷改善脂肪细胞胰岛素抵抗的作用及机理研究”（2020D01C070）；新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题“管花肉苁蓉苯乙醇苷调控代谢性炎症改善脂肪胰岛素抵抗的作用及其机制”（2021D04019）作者简介：姜慰（1997-），女，硕士生，从事药食资源功能活性及机体健康的研究，E-mail:通讯作者：王为兰（1987-），女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事药食资源功效与营养健康的研究，E-mail:462新疆大学学报（自然科学版）（中英文）2023年the glucose content in the supernatant of cell culture.At the same time,the stability of IR-HepG2 cell modelwas detected after removing inducers.IR-HepG2 cells were treated with three kinds of natural polysaccharidesat different concentrations.The effects of polysaccharides on cell viability and insulin resistance were detectedby MTT and glucose oxidase methods respectively.Dexamethasone(3.75 mol/L)combined with insulin(0.001mol/L)can successfully induce IR-HepG2 cell model in high glucose culture condition,and has no significanteffect on cell activity,and the model can keep stable within 72 hours.Lycium barbarum polysaccharides had betterhypoglycemic effects in vitro.Key words：insulin resistance;HepG2 cells;Pleurotus eryngii polysaccharides;Ziziphus jujuba polysaccharides;Lycium barbarum polysaccharides0引 言糖尿病是一种发病率较高的慢性代谢紊乱疾病，其发病率在全球范围内呈稳步上升趋势，严重危害人体健康1 目前，我国患糖尿病人数最多，其中型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）占糖尿病患者总人数的90%95%2 肝脏是胰岛素的主要靶组织，维持肝脏葡萄糖输出与储存的生理稳态 人肝癌细胞系HepG2因具有正常人肝细胞的多种功能而被广泛用于高血糖和糖尿病的研究3胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）是T2DM典型的病理特征和疾病基础，持续存在于T2DM发生发展的全过程，并起着推动性作用4；IR主要特征是机体靶组织对胰岛素的敏感性降低及胰岛素分泌相对缺乏，导致目标组织中葡萄糖的摄取和利用减少5 因此，提高胰岛素敏感性已成为治疗T2DM的一个关键目标针对型糖尿病患者开发的药物主要包括双胍类、磺脲类、噻唑烷二酮类、-糖苷酶抑制剂、胰岛素增效药-胰高血糖素样肽-1受体激动剂等67 注射胰岛素是目前临床口服降糖药不能达到血糖控制效果时型糖尿病患者常用的治疗方法8 但长期口服降糖药物或与胰岛素联用易造成患者靶器官钝化、药效低、血糖波动幅度大，还会产生体重增加、水肿、心衰、胃肠道反应及低血糖或乳酸中毒等副作用9 因此，研究开发新型安全高效、毒副作用较小的治疗药物是现阶段糖尿病治疗的重要任务10 多糖是一种或多种单糖由糖苷键连接的天然大分子物质，是生物高分子家族中最重要的成员之一1112 据报道，植物多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血脂、降血糖等多种药理作用13 本文探讨IR-HepG2模型的建立方法，并应用IR-HepG2模型对3种天然多糖的体外降糖活性进行比较，为胰岛素抵抗细胞模型的建立及多糖降糖药物的研发奠定基础1材料与方法1.1实验材料与试剂人肝癌细胞系HepG2细胞和杏鲍菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharides,PEPS，多糖含量为53.85%）、红枣多糖（Ziziphus jujuba polysaccharides,ZJPS，多糖含量为87.6%）、枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides,LBPS，多糖含量为99.7%）均源于新疆大学新疆生物资源基因工程重点实验室；DMEM高糖培养基、磷酸缓冲液（PBS）、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）和地塞米松（Dexamethasone,Dex）均购于Gibco公司；胎牛血清购于ABW公司；胰岛素（Insulin,INS）购于诺和诺德中国制药有限公司；二甲双胍（Metformin,Met）购于Solarbio公司；葡萄糖检测试剂盒购于上海荣盛生物科技有限公司1.2仪器与设备细胞恒温培养箱：美国Thermo公司；超低温冰箱、超净台、台式离心机：美国Beckman公司；全波长酶标仪：美国Bio-Rad公司1.3实验方法1.3.1HepG2细胞培养将从液氮罐中取出的HepG2细胞快速融解，加入含双抗、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，放置在37、5%CO2的恒温培养箱中，取对数生长期的细胞进行实验1.3.2样品预处理将地塞米松溶于无水乙醇配制成浓度为2 mmol/L的溶液，4保存备用，使用前稀释至终浓度为1.25、2.5、3.75mol/L 胰岛素注射剂4保存备用，使用前稀释至终浓度为0.1、0.01、0.001mol/L 将MTT溶于PBS中配制成浓度为1 g/mL的溶液，使用前稀释至终浓度为0.5 mg/mL 称取一定量的多糖溶于超纯水中配制成浓度为20 mg/mL的多糖溶液，置于-20保存，使用前稀释至终浓度为200、400、800g/mL第4期姜 慰，等：HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立及在筛选天然有效多糖中的应用4631.3.3不同诱导剂对HepG2细胞活性的影响以不同剂量的地塞米松、胰岛素单独