超高剂量率放疗和常规放疗对小鼠脾脏辐射损伤的转录组学比较研究.pdf

第卷增刊原子能科学技术 ，年月 超高剂量率放疗和常规放疗对小鼠脾脏辐射损伤的转录组学比较研究伍丽君，杨天宇，许竞泽，帅立雄，张永胜，（苏州大学附属第二医院 整形美容科，江苏 苏州 ；苏州大学附属第二医院 病理科，江苏 苏州 ）摘要：为揭示 的潜在作用机制，本文研究了超高剂量率放疗（）和常规放疗（）对小鼠脾脏基因表达谱的影响。将 只 雄性小鼠按照随机数字法分为健康对照组（组）、常规照射组（组）和超高剂量率照射组（组）。组和 组采用相应的方式对小鼠进行腹部照射，剂量均为 ，照后将小鼠脱颈处死，收集脾脏组织，提取总。通过转录组测序技术和生物信息学分析方法，探究小鼠受照后脾脏组织基因表达谱的变化。结果显示：组与 组之间共有 个差异表达基因（），其中上调基因 个、下调基因 个；组与 组之间共有 个差异表达基因，其中上调基因 个、下调基因 个；组与 组之间共有 个差异表达基因，其中上调基因 个、下调基因 个。基因本体论（）分析显示，组与 组中的 主要涉及对其他生物的防御反应及与其他生物细胞和双链 结合等功能，组与 组中的 主要涉及对其他生物的防御反应及与宿主细胞细胞质和双链 结合等功能。京都基因与基因组百科数据库（）分析显示，组与 组之间小鼠脾脏组织的差异基因涉及 样受体信号通路及抗原加工提呈等多种通路，组与 组之间小鼠脾脏组织的差异基因涉及单纯疱疹感染及 样受体信号通路等多种 通路。本研究展示了 和 可引起小鼠脾脏组织中基因表达谱的改变，这些 涉及多种放射生物学相关的功能通路，可以降低辐射引起的脾损伤，其机制可能与免疫应答引起的辐射抵抗有关。关键词：超高剂量率放疗；脾脏；测序；基因表达中图分类号：文献标志码：文章编号：（）收稿日期：；修回日期：基金项目：省部共建放射医学与辐射防护国家重点实验室开放基金（，）；中核集团“青年英才“项目；中核医疗“核医科技创新”项目核应急医学领域重点项目（）；苏州市科技发展项目（，）通信作者：张永胜：，（，；，）：（）（），（），（）（），（），（），：；放射治疗（）是对抗肿瘤的重要手段，长期以来一直是癌症治疗的基石，癌症患者中 约 需 要 接 受 放 射 治 疗。然而，在向肿瘤细胞提供致命剂量的同时，还会不可避免地辐射周围正常组织，可能会严重影响癌症患者的健康和生活质量。超高剂量率放疗（）是一种新兴的治疗技术，它以超高剂量率（）提供辐射，照射时间一般小于。临床前数据已经证实，与 相比，可以明显提升正常组织对辐射的耐受性，该效应在不影响对肿瘤杀伤效果的情况下，可以显著减少正常组织中辐射诱导的毒性。最近发表的一项 治疗骨转移瘤的首次临床试验表明，在临床环境中是可行的。如果 的优势 在临床试验中得 到证实，这种新技术可能会改变放射肿瘤学领域，成为某些肿瘤的主要放射治疗方式，甚至可能在未来取代传统放射治疗。尽管这种新技术有巨大的前景，但迄今为止 的放射生物学机制尚不明晰。因此阐明其生物学机制对基础研究和临床应用具有重大意义。最近有研究表明，与 相比，可能诱发免疫应答，包括循环免疫细胞、肿瘤微环原子能科学技术第 卷境和炎症反应。此外，脾脏是关键的免疫效应器官，因为它可以通过协调先天和适应性免疫反应，如病原体清除、细胞因子产生和细胞分化，发挥调节作用，平衡促炎和抗炎反应。综上所述，免疫调节可能在 机制中发挥重要作用，但 后的免疫反应还有待进一步研究。本研究拟以 雄性小鼠为研究对象，观察 和 对脾脏组织形态学的影响，并探究 和 对小鼠脾脏辐射损伤的转录组学表达谱差异，深入研究 的生物学机制，为进一步提升肿瘤的治疗效果提供理论基础和实验依据。材料与方法 实验动物 雄性小鼠 只，周龄，体重 ，健康无特定病原体级，购于成都达硕实验动物有限公司（生产许可证号：（川），饲养于苏州大学无特定病原体级动物房屏障环境内，饲养温度 ，相对湿度 ，所有小鼠饲养周，适应环境后按体重随机区组法分为健康对照组（组，只）、常规照射组（组，只）和超高剂量率照射组（组，只）。仪器与照射小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后用胶布固定在塑料板上，以减少在辐射暴露期间的运动。辐照利用成都太赫兹自由电子激光设施的 研究平台进行，以 的剂量率对腹部进行单剂量 照射（源皮距为 ，射野为 ）。常规辐射采用 射线（，美国 公司）照射（源皮距为 ，射野为 ），以 的剂量率对腹部进行单剂量 照射。健康对照组小鼠在相同条件下正常饲养。样本收集和 染色分析 和 处理 后，常氧条件下用颈椎脱臼法处死小鼠，取研究所需的脾脏组织，经 （上海宏生生物有限公司）裂解法提取总 后，送北京诺禾致源科技股份有限公司进行 分析。脾脏标本经固定、石蜡包埋、切片、烘片、脱蜡复水后采用苏木素伊红染色，用中性树脂和盖玻片封片。文库制备及测序按照常规流程建库、获得 文库。文库构建完成后，先使用 进行初步定量，随后使用 对文库的插入片段进行检测，符合预期后，采用聚合酶链式反应（）对文库有效浓度进行准确定量（文库有效浓度高于 ），以保证 文 库质 量。库 检 合 格 后，用 进行测序，并产生 配对末端读数。数据分析使用 （）构建参考基因组索引，并使用 （）将配对末端 与参照基因组比对。）差异表达分析：使用 软件包（）进行。使用 方法调整值（为有统计学意义）。将 （）设定为显著差异表达的阈值。）分析：通过 （）软件实现差异表达基因的基因本体论（）富集分析，对各组差异基因进行功能分析，以注释并推测这些基因可能的作用。的条目为差异有统计学意义。）分析：通过京都基因与基因组百科数据库（）可以了解生物系统的高级功能和效用，如细胞、生物体和生态系统等。本研究使用 （）软件分析 通路中差异表达基因的统计富集。为显著富集的阈值。）差异 对应的基因启动子区域分析：使用 （）软件中的 插件预测靶基因的转录因子及 ，预测的 的 标 准 化 富 集 得 分（，）设定为。结果与讨论 和 对小鼠脾脏组织形态的影响 和 对小鼠脾脏组增刊伍丽君等：超高剂量率放疗和常规放疗对小鼠脾脏辐射损伤的转录组学比较研究织的影响如图所示。由图可见，与 组相比，组小鼠的脾脏组织间质中见大量炎细胞浸润，而 组小鼠的脾脏间质炎细胞浸润程度明显减轻。上述结果说明，与 相比，能明显降低脾脏组织的炎症反应。等以周龄雌性 小鼠为实验对象，皮下接种乳腺癌细胞 后，对腹部给予 剂量 （）或 （）照射，分析不同条件照射下脾脏组织的损伤情况以及对局部免疫应答的影响，结果同样提示，相比于，对小鼠脾脏的损伤更小。目前国内外关于免疫应答在 机制中作用的研究鲜见报道，需要更多的研究证实。基因差异表达分析与富集分析）和 对小鼠脾脏组织基因表达谱的影响 组、组 及 组小鼠的基因表达变化示于图。由图 可知，组与 组之间共有 个差异表达基因，其中上调基因 个、下调基因 个；这些基因中，上调幅度最大，下调幅度最大。对上述差异基因进行聚类图绘制，如图 所示。由图 可知，组与 组之间共有 个差异表达 基 因，其 中 上 调 基 因 个、下 调 基 因 个；这些基因中，上调幅度最大，下调幅度最大（图）。对上述差异基因进行聚类图绘制，如图 所示。组与 组之间共有 个差异表达基因，其中上调基因 个、下调基因 个。以上数据表明，使小鼠脾脏内源基因的表达发生了明显变化，且 组和 组之间差异表达基因的情况存在较大差异。）差异基因的 功能分析对 、及 组小鼠脾脏组织差异性表达的 ，从生物学过程、细胞成分、分子功能三个层次进行 富集分析，结果如图所示。由图可知，组和 组小鼠脾脏组织之间的差异基因涉及多种功能，如发生上调的生物进程中对其他生物的防御反应、对干扰素的应答、对病毒的应答等；细胞组分中的共生体、其他生物细胞、其他生物体成分等；分子功能中的双链 结合、核心启动子结合、低聚腺苷酸合成酶活性（图），以及发生下调的生物进程中的红细胞内稳态、红细胞发育、红细胞分化等；细胞组分中的抑制性突触、浆膜外侧锚定组分、浆膜外侧固有成分等；分子功能中的氧化还原酶活性、抗氧化活性、氧结合等功能图 、和 组小鼠脾脏组织形态的变化 ，原子能科学技术第 卷、与 的差异基因表达谱和差异基因表达火山图；、与 的差异基因表达谱和差异基因表达火山图图 、和 组小鼠脾脏组织基因表达谱 ，（图）。组和 组小鼠脾脏组织之间差异基因涉及多种 功能，包括发生上调的生物进程中对其他生物的防御反应、对病毒的应答、对病毒的防御反应等；细胞组分中的宿主细胞细胞质、宿主细胞组分、宿主细胞内区域等；分子功能中的双链 结合、低聚腺苷酸合成酶活性、核心启动子结合等功能（图），以及发生下调的生物进程中线粒体呼吸链复合体组装、抗菌体液反应、腺嘌呤核苷三磷酸（）代谢过程等；细胞组分中的胞质核糖体、核糖体亚单位、核糖体等；分子功能中核糖体的结构成分、分子结构活性、抗氧化活性等功能（图）。在 组与 组和 组与 组之间，显著上调的 节点均属于功能个亚类之中的生物过程。由以上结果推测，辐射对小鼠脾脏组织生物过程中的相关功能造成影响，从而影响脾脏的组织形态与炎症反应。对结果进一步分析发现，免疫相关的生物过程上调尤为突出，组与 组和 组与 组之间，对干扰素以及干扰素应答均上调，而干扰素可以促进增刊伍丽君等：超高剂量率放疗和常规放疗对小鼠脾脏辐射损伤的转录组学比较研究原子能科学技术第 卷和维持机体的免疫监视、免疫保护和免疫自我稳定等功能，推测 对免疫系统产生保护作用，这种保护作用可能会降低辐射对正常组织的损伤，这与 等的研究结果一致。）差异基因的 通路分析对 、及 组小鼠脾脏组 织 样 品 差 异 性 表 达 的 进 行 富集分析，结果如图所示。由图可见，组 与 组 之 间 小 鼠脾脏组织差异基因涉及核苷酸结合寡聚化结构域（，）样受体信号通路及抗原加工提呈等相关通路（上调，图）以及自噬、线粒体自噬等相关通路（下调，图）。组与 组之间小鼠脾脏组织差异基因涉及单纯疱疹感染及 样受体信号通路等上调的相关通路（上调，图），以及核糖体、氧化磷酸化等下调的相关通路（图）。组与 组之间小鼠脾脏组织差异基因涉及类固醇生物合成及萜类骨架生物合成等上调的相关通路，以及细胞因子细胞因子受体相互作用、酒精中毒等下调的相关通路。与 分析结果一致，富集分析也显示免疫相关通路上调，特别是 样受体信号通路、样受体信号通路以及 样受体信号通路等。研究表明，样受体（）、样受体（）以及 样受体（）是宿主的一类模式识别受体，可识别病毒的病原相关分子模式。通过、与 上调和下调；、与 的上调和下调 图不同辐射方式下小鼠脾脏组织中差异基因的 通路分析结果 增刊伍丽君等：超高剂量率放疗和常规放疗对小鼠脾脏辐射损伤的转录组学比较研究调控抗病毒天然免疫信号通路，从而调节抗病毒天然免疫应答。在进行 生物过程分析时发现，在对病毒的应答、对病毒的防御反应和病毒感染过程的负向调控中起重要作用，同样提示了免疫调节可能是 的一种潜在机制。诱导的 转录分析利用 分析差异 对应的基因启动子区域，预测基序的标准化富集得分（）设定为，筛选出相应的转录因子和基序。推测的转录因子及基序如表所列。由表可知，在 组与 组，转录因子 、和 等可能与上调的 有关，其中 和 的转录因子结合基序的 基序最高。转录因子 、和 等可能与下调的 有关。本研究发现在 组与 组 和 组与 组之间 以及 表不同条件下诱导的 转录分析结果 编号转录因子基因全称 靶标基序 信号转导因子和转录激活因子 干扰素调节因子 肝细胞核因子 转录因子 同源盒蛋白 转录因子 重组人热休克因子 结合蛋白 细胞急性淋巴细胞性白血病蛋白 血清应答因子 肌蛋白 赖氨酸去甲基化酶 程序性细胞死亡 干扰素调节因子 锌指蛋白 血清应答因子 干扰素调节因子 胶质细胞缺失因子 信号转导因子和转录激活因子 应答元件结合蛋白样 转录因子 酪氨酸色氨酸单加氧酶激活蛋白 细胞凋亡，胱冬酶激活抑制因子 易位变异体 去乙酰化酶 乙醛酸还原酶羟基丙酮酸还原酶 叉头框蛋白 早期生长应答因子 注：编号为 组和 组上调基因的 转录分析；编号 为 组和 组下调基因的转录分析；编号 为 组和 组上调基因的 转录分析；编号 为 组和