层生镰刀菌产生的有机挥发物对黄粉虫取食行为的影响.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:国家重点研发计划子课题()国家自然科学基金项目()山东省农业科学院农业科技创新工程项目()山东省自然科学基金项目()青岛西海岸新区 年度科技项目()作者简介:郭志青()女山东潍坊人博士助理研究员从事真菌毒素的防控和农产品安全研究:.通信作者:迟玉成()男山东莱西人博士研究员主要从事花生植物保护研究:.曹建敏()女山东青岛人硕士副研究员主要从事色谱质谱检测技术研究与开发:.层生镰刀菌产生的有机挥发物对黄粉虫取食行为的影响 郭志青许曼琳张霞李莹迟玉成曹建敏(.山东省花生研究所山东 青岛 .中国农业科学院烟草研究所山东 青岛)摘要:黄粉虫()是一种造成损失较为严重的世界性储粮害虫 本研究发现层生镰刀菌菌株.侵染的大米、小麦及玉米 种主粮基质均能够不同程度地吸引黄粉虫幼虫运用 技术初步判断层生镰刀菌吸引黄粉虫幼虫的主要有机挥发物成分为 石竹烯将 石竹烯标准品配制成 /并添加到高温灭菌的大米、小麦及玉米基质中其对黄粉虫幼虫有明显的吸引作用 本试验结果对防治储粮害虫(黄粉虫)具有重要意义关键词:层生镰刀菌有机挥发物黄粉虫取食行为中图分类号:.文献标识号:文章编号:()(.)()./.(.).粮食安全直接关系到国家安全和社会稳定储粮害虫是直接影响粮食产量和品质的重要因素之一 储粮害虫种类多、适应性强、分布广、繁殖力高可使储藏主粮、中药材、食品、干果等遭受巨大损失 近年来随着社会经济的发展寻找绿色储粮害虫防治方法来替代化学保护剂和熏蒸剂的研究越来越受到人们的重视真菌挥发性物质()是指真菌产生的各种含碳气态化合物的混合物具有分子量小、易挥发、能在空气和土壤中自由扩散等特性 真菌 可介导微生物和昆虫之间的生态相互作用如锈菌可以侵染芸苔科植物通过改变寄主叶片形态产生真菌假花(“”)真菌假花通过分泌花蜜释放花香来吸引传粉昆虫帮助真菌完成有性繁殖树蜂(.)可非常敏感地躲避伴生菌()定殖的寄主植物这表明具有相似生活史的昆虫可能通过 分割宿主资源以减少竞争相互作用 白僵菌()侵染叶片释放的 对捕食者花蝽(.)有驱避作用真菌 也可用于食品生产:通过检测 建立模型可推测田间作物真菌侵染程度或储存粮食和食品中的真菌腐败程度 因其在植物病害防治中具有独特应用价值利用不同 控制植物病虫害已成为当前国内外研究的热点多种真菌 的杀虫活性已被证实例如.产生的挥发性有机物包括亚硝基酰胺()已被证明可以杀死昆虫 产生的萘用于制造“樟脑丸”是一种非常有效的驱虫剂石竹烯()是一种常见的萜类化合物 石竹烯的药理作用主要有局部麻醉作用、治疗结肠炎、镇咳等 石竹烯在昆虫化学通讯中的意义已经被报道但对于不同昆虫行为的影响不同 比如:石竹烯是越冬期异色瓢虫()成虫的聚集素对雌虫和雄虫都有很强引诱作用对桃蚜()和棉蚜()有驱避作用对蛇麻疣额蚜()有引诱作用 石竹烯目前主要从青篙、松节油中获得而真菌产生 石竹烯以及 石竹烯对于黄粉虫取食行为的影响未见报道 本研究旨在探索 石竹烯对黄粉虫(储粮害虫)取食行为的影响黄粉虫()又称面包虫属鞘翅目拟步甲壳粉甲属是一种造成损失较为严重的世界性储粮害虫 等的试验表明黄粉虫具有从多种不同组分的食物中选择最有利于自身膳食平衡的食物的能力由此推断黄粉虫具有能够躲避取食对本身健康造成威胁食物的能力前期试验发现尽管取食真菌侵染的小麦后因为真菌毒素的污染会导致黄粉虫幼虫死亡但黄粉虫幼虫对层生镰刀菌侵染的小麦颗粒取食具有趋向性 我们推断这种取食趋向可能与层生镰刀菌的挥发物有关此种挥发物对黄粉虫幼虫有吸引作用然而具体是哪种挥发物起作用并不清楚 本研究用层生镰刀菌.侵染大米、小麦和玉米 种基质观察黄粉虫幼虫对 种被侵染基质的取食反应并运用顶空固相微萃取()技术收集气相色谱质谱联用仪()鉴定、分析层生镰刀菌.在不同基质上的挥发物组分最终明确吸引黄粉虫幼虫的有机挥发物成分为控制仓储害虫、提高农产品品质提供技术参考 材料与方法.试验材料层生镰刀菌菌株.()由山东省花生研究所分离并保存大米品种为稻花香小麦品种为济麦 玉米品种为登海 黄粉虫幼虫购于山东德州黄粉虫生态养殖场于温度()、相对湿度 的 恒温恒湿培养箱内养殖挑选发育良好、身体健壮的幼虫用做试验.层生镰刀菌.侵染不同基质用灭菌水浸泡大米(小麦、玉米)沥水称取 (玉米称取 )分装到灭菌的 锥形瓶中加入 灭菌水(补给高温灭菌过程中蒸发掉的水分)后高温灭菌 冷却到室温 将 层生镰刀菌孢子悬浮液(个/)菌液接种到灭菌大米(小麦、玉米)上混合均匀后用封口膜将锥形瓶封上对照组用灭菌水代替孢子悬浮液 每个处理重复 次 侵染后的大米、小麦和玉米 恒温培养 .层生镰刀菌侵染的基质对黄粉虫幼虫取食影响用记号笔将直径为 的灭菌培养皿平均分为 个部分称取层生镰刀菌完全侵染和灭菌没有侵染(对照)的大米各 依次放在培养皿 个区域的边缘位置并确保从培养皿中心到基质的距离相等在培养皿中心放入 只黄粉虫幼虫(黄粉虫幼虫在试验前 停止喂食)将培养 第 期 郭志青等:层生镰刀菌产生的有机挥发物对黄粉虫取食行为的影响 皿放在黑暗中 每次 个重复共进行 次试验 黄粉虫幼虫对层生镰刀菌侵染的小麦、玉米的取食趋向试验同上 统计 种基质黄粉虫幼虫在培养皿 个不同区域的数量并进行数据分析黄粉虫幼虫取食偏好()目标基质所在区域黄粉虫数量之和/.层生镰刀菌挥发性代谢产物鉴定.仪器与试剂美国安捷伦 气相色谱质谱仪手动萃取手柄/萃取头 透明锥形瓶正构烷烃()购自北京百灵威科技有限公司 所用条件:弹性毛细管色谱柱规格为 .衬管为.专用衬管分流比为 进样口温度载气为.的氦气流速为./柱温箱:初始温度 保持 以/速率升至 以 /速率升至最后以 /速率升至 保持 离子源全扫描模式扫描范围 .层生镰刀菌挥发性代谢产物收集将.中获得的层生镰刀菌侵染的不同基质和空白对照室温下静置.后进行采样 用铁架台固定萃取探针和顶空瓶将 针管刺入锥形瓶中推动手柄杆使纤维头伸出针管 萃取头置于锥形瓶的上部空间采样时间为.收集完毕后将萃取头收起并将针管拔出样品瓶待 分析实施过程中先采集空白对照目的是为了排除培养基释放的挥发物和萃取头涂层流失对细菌挥发物鉴定结果的干扰.吸附正构烷烃()探针制作量取一定量正构烷烃()溶液于锥形瓶中在室温中静置.后进行采样 采样时用铁架台固定萃取探针将 针管刺入锥形瓶推动手柄杆使纤维头伸出针管 萃取头置于样品的上部空间采样时间为.收集完毕后将萃取头收起并将针管拔出样品瓶待 分析.层生镰刀菌挥发性代谢物定量分析以挥发性代谢物总离子流色谱图峰面积的相对比例表示产生代谢物的相对量 以大米、小麦和玉米 种基质中 石竹烯总离子流色谱峰面积为计算相同基质中层生镰刀菌其他代谢组分相对于 石竹烯的含量 以大米中产生的每种挥发性代谢物总离子流色谱峰面积为 计算小麦和玉米中挥发性代谢物相对大米中该组分的相对含量.石竹烯对黄粉虫幼虫吸引的验证试验为验证层生镰刀菌产生的 石竹烯是吸引黄粉虫幼虫的主要成分将 石竹烯标准品配制成 /的标准品溶液并分别添加 到盛有灭菌的大米、小麦及玉米基质的锥形瓶中 种基质的重量及锥形瓶的规格同.密封平衡 后将空白对照基质和加入 石竹烯处理的基质分别放在直径为 的培养皿中 培养皿的划分及基质的放置同.在培养皿的中间放入 只黄粉虫幼虫每次 个重复 将培养皿放在黑暗中 统计黄粉虫幼虫在 个划分区域的数量 试验重复 次.数据统计与分析利用 进行数据整理图表数据均以平均值标准误表示 结果与分析.层生镰刀菌侵染的基质对黄粉虫幼虫取食影响结果(图)表明:黄粉虫幼虫偏爱取食层生镰刀菌侵染过的基质 层生镰刀菌侵染的基质对黄粉虫幼虫有不同程度的吸引相较于对照侵染大米能够吸引 的黄粉虫幼虫侵染小麦能吸引 的黄粉虫幼虫侵染玉米吸引 的黄粉虫幼虫 层生镰刀菌侵染的玉米吸引黄粉虫的效果相对较差图 黄粉虫幼虫对层生镰刀菌侵染大米、小麦、玉米取食偏好山 东 农 业 科 学 第 卷.层生镰刀菌挥发性代谢产物分析.挥发物 分析将.获得的吸附挥发物的萃取头在全扫描模式下进行分析得到不同培养基质中空白对照样品挥发物、层生镰刀菌挥发性代谢物和正构烷烃()的总离子流图其中大米、小麦和玉米 种培养基质中层生镰刀菌挥发性代谢产物 总离子流图分别见图、图、图 图 层生镰刀菌侵染大米基质后产生的 挥发性代谢物总离子流图图 层生镰刀菌侵染小麦基质后产生的 挥发性代谢物总离子流图图 层生镰刀菌侵染玉米基质后产生的 挥发性代谢物总离子流图.目标挥发物谱库检索将层生镰刀菌挥发物总离子流图与空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰扣除即为层生镰刀菌在不同培养基质下释放的挥发性特征指纹峰使用 和 谱库对特征指纹峰进行定性识别设置匹配度阈值为 结果见表 层生镰刀菌的挥发性代谢产物主要有 种其中 石竹烯产量最高其他 种组分在 和 库中匹配率虽然大于 但计算得到正构烷烃保留指数与文献报道相差较大所以不能确定挥发物结构式暂定为未知、未知、未知 表 层生镰刀菌挥发性代谢物定性鉴定结果峰编号保留时间()中文名称英文名称结构式计算文献.石竹烯.未知.未知.未知 注:为保留指数().层生镰刀菌挥发性代谢物定量分析以大米、小麦和玉米三种基质中 石竹烯总离子流色谱峰面积为 计算相同基质中层生镰刀菌其他代谢组分相对于 石竹烯的含量 由表 可知大米中未知、组分含量均低于 石竹烯含量的小麦和玉米基质中未知组分 所占比例高于大米占 石竹烯含量的 以上另外两种均不到 石竹烯含量的 以大米中产生的每种挥发性代谢物总离子流色谱峰面积为 计算小麦和玉米中挥发性代谢物相对大米中该组分的相对含量结果见表 大米基质中层生镰刀菌产生的挥发性代谢物总量最高其次为小麦玉米最少 表 相同基质中层生镰刀菌挥发性代谢产物 相对含量(以 石竹烯为参照)()基质石竹烯未知 未知 未知 大米.小麦.玉米.石竹烯对黄粉虫幼虫吸引的验证试验由图 可知黄粉虫幼虫偏爱取食 石竹烯处理过的基质 石竹烯处理过的基质对黄粉虫幼虫有不同程度的吸引相较于对照石竹烯处理的大米能够吸引 的黄粉虫幼虫来取食石竹烯处理的小麦能够吸引 的黄粉虫幼虫石竹烯处理的玉米吸引 的黄粉虫幼 第 期 郭志青等:层生镰刀菌产生的有机挥发物对黄粉虫取食行为的影响 虫 石竹烯处理的基质吸引黄粉虫幼虫明显高于层生镰刀菌侵染的这可能与层生镰刀菌侵染的基质有其他有机挥发物的干扰有关 表 不同基质中镰刀菌侵染挥发性代谢产物 相对含量(以大米为参照)()基质石竹烯未知 未知 未知 总量大米小麦.玉米.图 黄粉虫幼虫对 石竹烯处理大米、小麦、玉米的取食偏好 讨论与结论本试验研究了层生镰刀菌有机挥发物对黄粉虫取食的影响 在前期试验的基础上本试验增加了大米、玉米两种基质结果发现层生镰刀菌侵染后的大米、小麦、玉米对黄粉虫幼虫有不同程度的吸引作用 因此我们推断层生镰刀菌产生的 对黄粉虫的取食有吸引作用 运用 技术对层生镰刀菌挥发性代谢物进行定性、定量分析初步判断层生镰刀菌吸引黄粉虫幼虫的主要有机挥发物成分为 石竹烯层生镰刀菌产生的 不止本试验检测到的 种本研究只关注峰面积最高的物质并在 和 库中匹配判定为 石竹烯 此外不同菌株的 种类不同利用实时直接分析质谱()绘制的 图谱指纹显示产毒镰刀菌真菌的物种具有特异性 石竹烯除了药理方面作用在环境保护、清洁空气等方面也有比较广的用途 在工作和生活的各种环境中均存在臭氧低浓度的臭氧对人体无害但浓度过高会对身体产生伤害 目前使用的空气清洁剂多为萜类化合物由于 石竹烯的二萜结构上含有两个双键很容易和臭氧反应可以很好地除去空气中的臭氧起到净化空气的作用本研究中层生镰刀菌的挥发物 石竹烯对储粮害虫黄粉虫幼虫有吸引作用对于诱杀储粮害虫有很好的应用前景 并且我国国家标准化管理委员会规定 石竹烯可以用作食品用天然香料()因此石竹烯对人畜无害可以作为引诱剂用于储粮害虫的防治有效控制和降低粮食产品中储粮害虫的危害对于提高农产品品质有重要意义参 考 文 献:.:.(/):.():.():.(:).:.():.():.():.():.():.山 东 农 业 科 学 第 卷():.