藏羊源致病性大肠杆菌的分离鉴定.pdf

42 2023.8试验研究0 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是人和动物肠道内的常在菌，也可引起人和牛、羊、猪及禽类的疾病，大肠杆菌病是畜牧养殖中最常见的疾病之一，严重影响我国收稿日期：2023-06-01作者简介：王冬经（1992-），女，云南宣威人，研究实习员，研究方向：高原动物传染病学。王冬经藏羊源致病性大肠杆菌的分离鉴定J现代畜牧科技，2023，99（8）：42-45doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.010WANG DongjingIsolation and Identification of Pathogenic Escherichia Coli from Tibetan SheepJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：42-45藏羊源致病性大肠杆菌的分离鉴定王冬经1，2（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏 拉萨 850000）摘要：为确定拉萨市某羊场藏羊发生腹泻、便血、食欲不振、消瘦等症状的病因，采集新鲜血便，进行病原的分离培养，并进行生化鉴定、PCR鉴定和遗传进化分析。结果显示，从藏羊血便、稀粪中分离得到5株细菌，分离株在麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上的菌落形态均与大肠杆菌一致，将分离株分别命名为XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4、XZ-5；分离菌可以分解葡萄糖、果糖、明胶、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、尿素酶，硫化氢试验呈阴性；PCR鉴定结果与预期相符，得到大小约为1 500 bp的目的条带；序列分析结果显示，5株分离株之间的同源性为98.7%100%，与大肠杆菌参考株的同源性为98.5%100%，分离株与肠炎沙门氏菌的同源性为96.7%96.9%，与枯草芽孢杆菌分离株的同源性为77.6%79.1%；分离株16S rRNA基因进化树显示，5株分离株与大肠杆菌处于同一支，而与肠炎沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均处于不同分支。研究结果证实，引起藏羊便血、腹泻的病原为大肠杆菌，为该病的防控提供科学依据。关键词：藏羊；大肠杆菌；分离鉴定中图分类号：S858.26文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.010Isolation and Identification of Pathogenic Escherichia Coli from Tibetan SheepWANG Dongjing1，2（1.Tibet Livestock Research Institute，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Science，Lhasa Tibet 850009，China；2.State Key Laboratory of Highland Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement，Lhasa Tibet 850009，China）Abstract：To determine the etiology of diarrhea，blood in stool，loss of appetite and wasting in Tibetan sheep on a sheep farm in Lhasa，fresh blood stool was collected，isolated and cultured for pathogens，and subjected to biochemical identification，PCR identification and genetic evolutionary analysisThe results showed that five strains of bacteria were isolated from blood stool and diluted feces of Tibetan sheep，and the colony morphology of the isolates on McConkey medium and Erythromax blue medium were consistent with E.coli，and the isolates were named XZ-1，XZ-2，XZ-3，XZ-4，XZ-5；the isolates could decompose glucose，fructose，gelatin，mannitol，maltose，sorbitol，lactose，urease，and hydrogen sulfide The PCR identification results were as expected，and the target bands of about 1 500 bp in size were obtained；the sequence analysis results showed that the homology among the five isolates was 98.7%100%，and the homology with the E.coli reference strain was 98.5%100%The homology of the isolates with Salmonella enterica was 96.7%96.9%，and the homology with Bacillus subtilis isolates was 77.6%79.1%The 16S rRNA gene evolutionary tree of the isolates showed that the five isolates were in the same branch with E.coli，while they were in different branches with Salmonella enterica and Bacillus subtilisThe results of the study confirmed that the pathogen causing blood in stool and diarrhea in Tibetan sheep is E.coli，which provides a scientific basis for the prevention and control of the diseaseKeywords：Tibetan sheep，Escherichia coli，isolation and identification432023.8试验研究牛、羊产业的健康发展。大肠杆菌可分为致病性大肠杆菌和非致病性大肠杆菌1，培养条件简单，在伊红美蓝培养基平板上形成带金属光泽的菌落，在麦康凯培养基平板上生长为粉红色菌落2，临床中可根据这一培养特性可初步诊断该病。大肠杆菌可感染多种动物和人，其中羊大肠杆菌病是由于羔羊或成年羊感染了致病性大肠杆菌而发生的一种急性、致死性的传染病，本病的传染性极强，特别是在哺乳时的羔羊易遭受大肠杆菌的侵袭，临床上可分为败血型和肠炎型2种，饲养管理不当、饲养环境不良、乳头不净或护理不当时常发此病3。大肠杆菌造成的羔羊腹泻十分普遍，大肠杆菌病发生后，若不采取针对性措施予以治疗，则可能造成大量羔羊死亡，给养殖场造成严重的经济损失，严重威胁养羊业的健康发展4。据资料显示，除了单一感染的情况外，大肠杆菌常常与羊产气荚膜梭菌、支原体、巴氏杆菌等混合感染，造成更加致命的危害5。由于羊养殖期间大量使用抗菌药物，造成羊源大肠杆菌耐药株不断增多，耐药机制日趋复杂，给羊疾病的防治带来严峻挑战6。藏羊又称为藏系羊或藏系绵羊，是由古羌人驯化的羌羊流传而来，形成历史悠久，目前主要分布于我国西藏、甘肃、四川、云南等高海拔地区，对高原恶劣的生态环境具有很强的适应能力，是中国三大粗毛绵羊品种之一，是青藏高原地区农牧民的主要生产和生活资料7，是青藏高原地区重要的家畜，对当地经济社会发展具有重要意义。冬春交替之际，藏羊常发生腹泻病，病羊出现腹泻、便血、食欲不振、消瘦等症状，疑似为羊大肠杆菌病，本研究旨在分离拉萨养殖场藏羊腹泻的病原菌，为该病的防治提供一定参考。1 材料与方法1.1 试验材料从拉萨市318公路沿线某养殖场无菌收集新鲜的藏羊血便或稀粪，低温保存，快速运送至实验室，进行病原菌的分离和培养。1.2 分离培养与染色镜检取少许藏羊粪便接种于LB（Luria-Bertani）培养基，摇菌，过夜。将过夜培养的菌液划线至伊红美蓝培养基和麦康凯固体培养基进行分离纯化，直至得到单克隆菌落。1.3 生化鉴定选取葡萄糖、果糖、明胶、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、尿素酶和硫化氢9种微量生化鉴定管进行分离株生化检测。操作过程严格遵照说明书进行。1.4 分子生物学鉴定分别取2 mL分离株菌液，提取其DNA，合成16S rRNA通用引物，进行PCR扩增，并将产物送至公司进行序列测定。通过NCBI进行序列比对分析，下载参考菌株序列，见表1，进行同源性分析、构建进化树。表1 16S rRNA参考菌株菌株种属菌株名称登陆号来源国家大肠杆菌7MK621226.1不详中国大肠杆菌54MK621257.1不详中国大肠杆菌174MH671474.1猪中国大肠杆菌A3CBS20-21（1）-E OL757525.1不详韩国大肠杆菌ECMN083306.1不详中国大肠杆菌EGI306MN704514.1不详中国大肠杆菌EGI311MN704518.1不详中国大肠杆菌IADCAMB11MH619508.1食品印度大肠杆菌ICMP 20884MG786395.1水新西兰大肠杆菌JCD08MH532537.1不详中国大肠杆菌JCD09MH532539.1不详中国大肠杆菌Mos.Rock dustMF496270.1不详埃及大肠杆菌Mu-5OP889004.1不详土耳其大肠杆菌VTM4R8KJ585689.1北美驼鹿美国大肠杆菌Y4-2MT192517.1不详中国肠炎沙门氏菌S85_0453MT621365.1家禽马来西亚枯草芽孢杆菌HSY21MT513998.1土壤中国2 结果2.1 分离培养从藏羊血便、稀粪中分离得到5株细菌，分离株在麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上的菌落形态均与大肠杆菌一致，将分离株分别命名为XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4、XZ-5。2.2 生化鉴定对分离株进行生化特性检测，结果显示分离株均可分解葡萄糖、果糖、明胶、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、尿素酶，硫化氢试验呈阴性，生化检测结果与大肠杆菌的生化特性一致。2.3 16S rRNA PCR鉴定结果PCR鉴定结果与预期相符，得到大小约为1 500 bp的目的条带，见图1。M：Trans2K Plus DNA Ladder；1、2、3、4、5：依次代表分离株XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4、XZ-5图1 分离菌株16S rRNA基因PCR扩增结果2.4 序列分析序列分析结果，见表2。5株分离株之间的同源性为98.7%100%，与大肠杆菌参考株的同源性为1 500 bpbp5 0003 0002 0001 000750500250100M1 2 3 4 544 2023.8试验研究98.5%100%，其中XZ-1与大肠杆菌参考株的同源性为98.6%99.9%；XZ-2与大肠杆菌参考株的同源性为99.1%99.9%；XZ-3与大肠杆菌参考株的同源性为99.0%100%；XZ-4与大肠杆菌参考株的同源性为99.3%100%；XZ-5与大肠杆菌参考株的同源性为98.5%100%。分离株与肠炎沙门氏菌的同源性为96.7%96.9%，与枯草芽孢杆菌分