苍术多糖与正丁醇部位对脾虚大鼠线粒体自噬的影响.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1372-1379苍术多糖与正丁醇部位对脾虚大鼠线粒体自噬的影响徐慧颖，丁奕辉,董辽宁中医药大学药学院,大连116 6 0 0摘要：多糖与正丁醇部位是苍术的健脾活性部位,本文从线粒体自噬的角度探讨苍术活性部位对脾虚大鼠的调节作用,进而阐释其健脾机制。采用透射电镜观察大鼠胃窦组织线粒体超微结构；采用qRT-PCR和Westernblot法检测大鼠胃窦组织线粒体PINK1、Pa r k i n、LC3和P62mRNA及蛋白表达水平；采用比色法检测大鼠胃窦组织三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate,ATP）、H,O 2 水平,JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位（MMP）水平。结果表明，与模型组相比,麸炒苍术多糖（FD）、麸炒苍术正丁醇部位（FZ）、生苍术多糖（SD）与生苍术正丁醇部位（SZ)均不同程度改善了脾虚大鼠胃窦组织线粒体结构损伤,且自噬溶酶体数量增多;FD、FZ、SD 与 SZ均能显著下调PINK1、Pa r k i n、p 6 2mRNA与蛋白表达，上调LC3I蛋白表达、LC3I/I值;FD与FZ组ATP、M M P水平显著上升,H,O2水平显著下降,SZ组ATP、M M P水平显著上升,SD组H,O,水平显著下降。综上所述，苍术多糖与正丁醇部位可能是通过改善自噬障碍，恢复线粒体功能，从而调节脾虚，且麸炒后多糖与正丁醇部位效果明显优于生品。关键词：苍术；麸炒；脾虚；多糖；正丁醇部位中图分类号：R285;R932D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.8.010Effects of polysaccharides and n-butanol fractions of AtractylodisRhizoma on mitophagy in rats with spleen deficiency昊,赵雪岑,柏白阳，才谦文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)8-137 2-0 8XU Hui-ying,DING Yi-hui,DONG Hao,ZHAO Xue-cen,BAI Yang,CAI QianCollege of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,ChinaAbstract:Polysaccharides and n-butanol fractions are effective fractions in Atractylodis Rhizoma(AR)for treating spleen de-ficiency.The study is to explore the mechanism of the effective fractions in AR on treating spleen deficiency from the perspec-tive of mitophagy.The ultrastructure of mitochondria in gastric antrum of rats was observed by transmission electron micro-scope.The mRNA and protein expression levels of autophagy-related proteins PINK1,Parkin,LC3 and p62 were detected byqRT-PCR and Western blot.The adenosine triphosphate（A T P)a n d H,O,l e v e l s i n g a s t r i c a n t r u m o f r a t s w e r e d e t e c t e d b ybiochemical analysis,the level of mitochondrial membrane potential(MMP)were detected by JC-1.The results showed thatcompared with the model group,the polysaccharides of bran-processed AR(FD),n-butanol fractions of bran-processed AR(FZ),polysaccharides of crude AR(SD)and n-butanol fractions of crude AR(SZ)improved the mitochondrial structure in-jury and increased the number of autophagic lysosomes in different degrees.FD,FZ,SD and SZ significantly down-regulatedthe expression of PINK1,Parkin and p62 mRNA and protein,and up-regulated the expression of LC3II protein and LC3II/Ivalue;the levels of ATP and MMP in FD and FZ groups increased significantly,while the levels of H,O,decreased significant-ly,the levels of ATP and MMP in SZ group increased significantly,while the levels of H,O,in SD group decreased significant-ly.In summary,the polysaccharides and n-butanol fractions of AR may treat spleen deficiency by promoting mitophagy andimproving mitochondrial function of gastric antrum,and the effect of polysaccharides and n-butanol fractions of bran-processedAR were obviously superior to that of crude AR.Key words:Atractylodis Rhizoma;bran-processed;spleen deficiency;polysaccharides;n-butanol fractions脾虚属脏腑辩证中常见之证型,通常表现为消收稿日期:2 0 2 3-0 1-0 9基金项目：国家自然科学基金（8 197 347 8）；兴辽英才计划（XLYC2002004)*通信作者 Tel:86-411-85890125;E-mail:caiqianmail 接受日期：2 0 2 3-0 5-2 9瘦、食欲不振、胃脘痛、胀气、乏力、面色萎焉、便糖等。脾虚表明机体处于低能量代谢状态,尤其与胃Vol.35肠功能障碍有关 。值得关注的是,线粒体是机体胃肠蠕动的重要能量来源,通过氧化磷酸化以ATP的形式产生能量,是“脾主运化”的重要环节 2 。氧化损伤、营养缺乏等外界刺激易导致线粒体损伤,对此,宿主细胞可启动自噬机制清除损伤的线粒体,维持细胞内的环境稳态 3。如自噬功能受损不能及时清除损伤的线粒体,可诱导细胞死亡。研究发现，脾虚动物骨骼肌、神经、肝脏、心肌等细胞中均发现线粒体自噬异常 4,5苍术 Atractylodes lancea（T h u n b.）D C 为菊科多年生草本植物,具有燥湿健脾之功效。中国药典规定其基源为菊科植物茅苍术或北苍术的根茎 6 。茅苍术野生资源主要分布于湖北、安徽宣城、江西武宁和陕西汉中等地区，北苍术野生资源主要分布东北、内蒙、河北等地区。传统认为江苏茅山地区的苍术质量最好,为道地药材。在泰国、日本等许多国家,苍术也常用来治疗消化系统疾病。现代药理研究表明，苍术可以调节大鼠血清中胃肠激素水平 7 ;苍术提取物对胃癌细胞（bgc-823和sgc-7901）8 与幽门螺杆菌的生长 9 均有抑制作用。苍术含有多种类型的化学成分,分别为挥发油、多糖、苷类和低极性非挥发物质。课题组之前研究发现，苍术多糖与正丁醇部位（苷类)对脾虚具有治疗作用 10 1,本实验是在此基础上，首次从线粒体自噬的角度对苍术有效部位调节脾虚的作用机制进行探究，旨在为苍术的合理应用奠定基础。1材料与方法1.1至药物与制备生茅苍术采自于湖北罗田中药种植基地（非道地药材），番泻叶购自海王星辰药店（生产批号：20210801），经辽宁中医药大学中药鉴定教研组许亮教授鉴定分别为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea（T h u n b.）D C.根茎、豆科植物狭叶番泻Cassia an-gustifolia Vahl的干燥小叶。1.1.1麸炒苍术正丁醇萃取物的制备取麸炒茅苍术（根据中国药典记载方法炮制），粉碎后过6 0 目筛。称取一定量粉末加8 倍量温水浸泡1h,80提取3h,提取出挥发油，提取液过滤，滤液减压浓缩作为水提液。药渣加人8 倍量70%的乙醇再次提取3h,过滤，滤液减压浓缩作为醇提液。合并上述水提液与醇提液，依次用二氯甲烷、正丁醇萃取3次，回收正丁醇溶剂得到麸炒苍术正丁醇萃取物,收率为3.2%。徐慧颖等：苍术多糖与正丁醇部位对脾虚大鼠线粒体自噬的影响1.1.3药液的配置根据课题组前期研究结果,苍术在0.945mg/g剂量下对脾虚大鼠有治疗作用，本次试验选取0.945mg/g剂量进行研究。结合收率将正丁醇萃取物加人0.5%羧甲基纤维素钠配制成0.0 12 g/mL的药液,折合生药量0.37 8 g/mL。结合收率将多糖加人蒸馏水配制成0.0 7 56 g/mL的药液，折合生药量 0.37 8 g/mL。1.1.4?番泻叶水煎液的制备称取适量番泻叶，加10 倍量水，大火烧开后再改小火煎煮30 min，过滤，滤液小火浓缩至含生药0.125 g/mL的水煎液。1.2三主要试剂及仪器ATP检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A095-1-1）;BCA 总蛋白定量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所,货号：A045-4-2）;H,0 2 检测试剂盒（上海Beyotime生物公司，货号：S0038）；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（上海Beyotime生物公司，货号：C2006）；c D NA 反转录试剂盒（德国Thermo公司，货号：#K1622）;ECL化学发光检测试剂盒（武汉百仟度生物科技有限公司，货号：Bal059）；PINK 1抗体（美国Affinity公司，货号：DF7742）；Pa r k i n 抗体（美国CST公司，货号：2132s）;p 6 2 抗体（美国CST公司，货号：2 32 14S）；LC3B抗体（美国Abcam公司，货号：ab192890）；-actin抗体（美国Abcam公司，货号：ab227387）；山羊抗兔抗、山羊抗小鼠抗（美国KPL公司，货号分别为:0 7 4-150 6,0 7 4-18 0 6)。HT7700型透射电子显微镜（日本hitachi公司）；7 54紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）;SpectraMax Gemini XPS型荧光酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）；荧光定量PCR仪（上海宏石医疗器械有限公司）;TGL-16型冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；L4158型扫描仪（EPSON公司）。1.3实实验动物与分组60只SPF级雄性SD大鼠，体质量（2 0 0 10)g，购于辽宁长生生物技术有限公司