不同生长年限固阳黄芪根际土壤微生物多样性及差异.pdf

第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.9 No.4Aug.2023文章编号：2096-0387（2023）04-05不同生长年限固阳黄芪根际土壤微生物多样性 及差异刘鸽，赵博，刘扬，李俊达，孙旭红，付树志，杨可青，郝佳瑞，刘惠荣*（内蒙古农业大学 生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）摘 要：研究内蒙古包头市固阳县不同生长年限黄芪根际土壤微生物群落结构变化，为进一步探索黄芪生长发育与根际微生物的关系及挖掘黄芪根际微生物功能提供理论基础。采集固阳县二年生、三年生黄芪根际土壤，利用高通量测序技术对两个不同生长年限的黄芪根际土壤细菌 16S rRNA 和真菌 ITS 序列进行测序分析。研究发现：不同生长年限黄芪根际土壤中主要优势细菌均为放线菌门、变形菌门；优势真菌为子囊菌门、被孢霉门、担子菌门。放线菌门、变形菌门、子囊菌门与担子菌门丰度随着黄芪生长年限增加均发生增大；不同生长年限黄芪根际土壤的主要优势细菌属均为节杆菌属、芽生球菌属、未命名属、微枝形杆菌属与类诺卡氏属，二年生黄芪根际土壤优势真菌属包括赤霉属、刺孢属、被孢霉属、毛壳霉属，三年生优势真菌属包括刺孢属、新刺毛茎点霉属、链格孢属、赤霉属；刺孢属丰度随黄芪生长年份的增加而增加，赤霉属变化却相反。关键词：固阳黄芪；根际土壤；微生物多样性中图分类号：R931.2 文献标识码：AMicrobialDiversityandDifferenceinRhizosphereSoilofGrowthYearsofAstragalus membranaceus inGuyangLIU Ge,ZHAO Bo,LIU Yang,LI Junda,SUN Xuhong,FU Shuzhi,YANG Keqing,HAO Jiarui,LIU Huirong*(College of Life Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)Abstract:The study of microbial community structure changes in the rhizosphere soil of Astragalus membranaceus in Guyang County,Baotou City,Inner Mongolia,during different growth years provided a theoretical basis for further exploring the relationship between the growth and development of Astragalus membranaceus and rhizosphere microorganisms,as well as exploring the function of Astragalus membranaceus rhizosphere microorganisms.Collecting the rhizosphere soil of 2-year-old and 3-year-old Astragalus membranaceus in Guyang County,using high throughput sequencing technology,the 16S rRNA sequences of bacteria and ITS sequences of fungi in the rhizosphere soil of two different growth years of Astragalus membranaceus are sequenced and analyzed.The research findings are as follows:The main dominant bacteria in the rhizosphere soil of Astragalus membranaceus with different growth years are Actinobacteria and Proteobacteria;the dominant fungi are Ascomycota,Mortierellomycota,Basidiomycota.The abundance of Actinobacteria,Proteobacteria,Ascomycota and Basidiomycota increased with the increase of Astragalus growth years.The main dominant bacterial genera in the rhizosphere soil of Astragalus membranaceus with different growth years are Arthrobacter,Blastococus,norank_ f_ JG30-KF-CM45,Microvirga,and Nocardioides.The dominant genera of fungi in the rhizosphere soil of 2-year-old Astragalus membranaceus include Gibberella,Phaeomycocentrospora,Mortierella,and Chaetomium.The dominant genera of fungi in the rhizosphere soil of 3-year-old Astragalus membranaceus include Phaeomycocentrospora,Neosetopsoma,Alternaria,and Gibberella.The abundance of Phaeomycocentrospora increased with the growth year of Astragalus membranaceus,while the variation of Gibberella was opposite.Keywords:Astragalus membranaceus in Guyang;rhizosphere soil;microbial diversity作者简介：刘鸽（1995），女，河北围场人，硕士在读，研究方向为环境资源微生物。通信作者：刘惠荣（1973），女，内蒙古呼和浩特人，博士，教授，研究方向为环境资源微生物。E-mail：。第 4 期11刘鸽等：不同生长年限固阳黄芪根际土壤微生物多样性及差异黄芪（Astragalus membranaceus）属豆科多年生草本植物，是我国大宗常用滋补类中药材，具有固表补气、托毒生肌、利水消肿、降血糖及抗病毒等功效1。现代药理学研究及临床应用表明，黄芪中的活性成分可起到抗肿瘤、抗衰老、多靶点免疫调节等作用，已被广泛用于相关疾病治疗。根际是土壤-根系-微生物三者紧密结合且相互影响的场所，不同植物都有其特定的根际微生物组群。相关研究表明，根际微生物群落中的不同微生物能够与植物进行互作，在促进植物生长、抑制土传病害、平衡土壤养分及提升养分利用率等方面具有重要意义2。目前科研工作人员对黄芪的研究侧重于黄芪的活性成分，仅有少量学者对黄芪根际微生物群落做了相关研究。此外，前人未曾对内蒙古固阳县不同生长年限黄芪根际土壤微生物群落结构进行研究。固阳县位于内蒙古中西部，典型的半干旱大陆性气候有利于黄芪有效成分的积累。调查发现，内蒙古黄芪生态种植主要集中在固阳县及其周边，且“固阳黄芪”已被国家核准注册为中国地理标志商标。目前，由于黄芪市场需求增加、多年生黄芪种植成本高及易感病，当地黄芪种植年限缩短至 2 年。因此本试验采用高通量测序技术，对内蒙古固阳县不同种植年限黄芪的根际微生物进行多样性分析，以期为黄芪种植及开发黄芪功能微生物提供参考依据。1 材料与方法1.1 试剂与仪器PowerSoil DNA Kit 试剂盒，美国 QIAGEN 公司；LSC-373G 型 4 冰箱，浙江星星冷链股份有限公司；DW-HL398S 型-80 低温冷冻箱，中科美菱低温科技股份有限公司；SX-500 高温高压灭菌锅，日本TOMY 公司；SW-CJ-1FD 型超净无菌工作台，苏州净化公司；ABI GeneAmp9700 型 PCR 仪，美国 ABI 公司；DYY-6C 电泳仪，北京六一生物科技有限公司。1.2 采样区概况及样品采集供试土样采于2021年7月，来源于固阳县二年生、三年生黄芪根际。在每个采样点随机布设 3 个 1.5 m 1.5 m 样方，每样方随机选取 5 株植株。采用抖根法收集土样，用毛刷将紧贴附于根系的土壤装入无菌自封袋，编号。两组黄芪根际土壤样品分别命名为-TYB（二年生黄芪根际土壤，取样地海拔 1 550 m，位于北纬 41 06 59、东经 110 18 54）、-TYA（三年生黄芪根际土壤，取样地海拔 1 540 m，位于北纬 41 06 56、东经 110 18 25）。将样品迅速放入 4 冰盒保存，及时带回实验室，将采集的土样分别放入 4 与-80 冰箱保存。1.3 土壤微生物基因组DNA的提取、PCR扩增及测序利用 PowerSoil DNA Kit 试剂盒提取根际土壤微生物总 DNA，使用 NanoDrop 2000 检测 DNA 浓度和纯度。用引物338 F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和 806 R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）扩增细菌 16S rDNA 序列的 V3-V4 区，用引物 ITS1F（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）和引物 ITSIF2R（5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）扩增真菌ITS1区。PCR 反 应 体 系：10Buffer 2 L，2.5 mmol/L dNTPs 2 L，rTaq 聚合酶 0.2 L，两条引物（5 mol/L）各 0.8 L，DNA 模版 10 ng，BSA 0.2 L，ddH2O 补足至 20 L。反应条件为 95 预变性 3 min，95 变性30 s、55 退火 30 s、72 延伸 45 s（细菌 27 个循环、真菌 35 个循环），72 延伸 10 min，4 保存。用 2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的片段及长度，并对合格产物进行纯化、定量，对纯化后的 PCR 产物建库，质检合格后使用 Illumina Miseq PE300 平台进行测序。1.4 数据分析与统计对所得原始测序序列进行质控拼接，根据 97%相似度对序列进行 OTU 聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier 对每条序列进行物种分类注释，比对 Silva 16S rRNA 数据库（Release 138）及 Unite 真菌数据库（Release 8.0），设置置信度阈值为 70%。并统计每个样本在不同物种分类水平下的群落组成。基于测序的数据，采用mothur 软件计算 Alpha 多样性、Chao、Shannon指数等，采用 Wilxocon 秩和检验进行 Alpha 多样性的组间差异分析；采用 Wilxocon 秩和检验在属水平进行组间差异显著性检验，确定丰度显著差异的微生物。2 结果与分析2.1 不同年份黄芪根际土壤微生物测序数据统计本次测序共得到细菌有效序列 290 249 条，平均长度约为 415 bp，测序质量值 Q30 为 93.38%93.40%，Q20 为 97.77%97.81%；真菌有效序列 321 885 条，12生物化工2023 年平均长度约为 235 bp，测序质量值 Q30 为 99.00%99