不同月龄A53T小鼠背根神经节中α-Syn表达变化.pdf

第5 9卷 第3期2 0 2 3年0 6月青 岛 大 学 学 报(医 学 版)J OUR NA LO FQ I N G D AOUN I V E R S I T Y(ME D I C A LS C I E N C E S)V o l.5 9,N o.3J u n e 2 0 2 3 收稿日期2 0 2 2-0 9-0 1;修订日期2 0 2 3-0 5-2 3 基金项目国家自然科学基金面上项目(3 2 1 7 1 1 3 1)第一作者韩帆(1 9 9 7-),女,硕士研究生。通信作者陈曦(1 9 8 0-),女,博士,副教授,硕士生导师。E-m a i l:c a s e y 1 2 0 11 6 3.c o m。不同月龄A 5 3 T小鼠背根神经节中-S y n表达变化韩帆,焦倩,杜希恂,阎春玲,姜宏,陈曦(青岛大学国家生理学重点(培育)学科,山东 青岛 2 6 6 0 7 1)摘要 目的 探讨不同月龄A 5 3 T转基因(A 5 3 T)小鼠脊髓背根神经节(D R G)中-突触核蛋白(-S y n)表达水平的变化。方法 6月龄和1 2月龄野生型(WT)小鼠和A 5 3 T小鼠经乌拉坦腹腔麻醉后处死,在体视显微镜下取出胸段、腰段和荐段的D R G组织,采用蛋白免疫印迹法检测D R G中-S y n的表达水平。结果 与相同月龄WT小鼠相比,6月龄及1 2月龄A 5 3 T小鼠D R G中-S y n表达量显著增加(F=5 9.1 6 4、5 5.6 8 1,P0.0 1);与6月龄A 5 3 T小鼠相比,1 2月龄A 5 3 T小鼠D R G中-S y n的表达量显著增加(F=1 3.8 0 2,P0.0 5)。结论 A 5 3 T小鼠D R G中-S y n表达量高于同月龄WT小鼠,且其表达量随年龄增长而增加。关键词 突触核蛋白;帕金森病;小鼠,转基因;神经节,脊 中图分类号 R 3 3 8.2 文献标志码 A 文章编号 2 0 9 6-5 5 3 2(2 0 2 3)0 3-0 3 3 7-0 4d o i:1 0.1 1 7 1 2/j m s.2 0 9 6-5 5 3 2.2 0 2 3.5 9.0 7 5 开放科学(资源服务)标识码(O S I D)网络出版 h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s 2/d e t a i l/3 7.1 5 1 7.R.2 0 2 3 0 7 1 9.1 6 1 8.0 0 3.h t m l;2 0 2 3-0 7-2 0 1 4:5 3:2 2E X P R E S S I O NO F-S Y N U C L E I NI NT H ED O R S A LR O O TG A N G L I O NO FA 5 3 T M I C E W I T H D I F F E R E N TA G E SI N MO N T H SHANF a n,J I A OQ i a n,D UX i x u n,Y ANC h u n l i n g,J I ANGH o n g,CHENX i(S t a t eK e yD i s c i p l i n e:P h y s i o l o g y(i n I n c u b a-t i o n),D e p a r t m e n to fP h y s i o l o g y,Q i n g d a oU n i v e r s i t y,Q i n g d a o2 6 6 0 7 1,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nl e v e lo f-s y n u c l e i n(-S y n)i nt h ed o r s a l r o o tg a n g l i o n(D R G)o fA 5 3 Tt r a n s g e n i cm i c ew i t hd i f f e r e n t a g e s i nm o n t h s.M e t h o d s W i l d-t y p e(WT)m i c ea n dA 5 3 T m i c e,a g e d6o r1 2m o n t h s,w e r es a c r i f i c e da f t e r i n t r a p e r i t o n e a la n e s t h e s i aw i t hu r e t h a n e.D R Gt i s s u es a m p l e so ft h et h o r a c i c,l u m b a r,a n ds a c r a ls e g m e n t sw e r ec o l l e c t e du n d e r a s t e r e o m i c r o s c o p e,a n dW e s t e r nb l o t t i n gw a s u s e d t om e a s u r e t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f -S y n.R e s u l t s C o m-p a r e dw i t ht h eWTm i c ew i t h t h e s a m e a g e i nm o n t h s,t h eA 5 3 Tm i c e a g e d6o r 1 2m o n t h sh a da s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e e x p r e s-s i o nl e v e l o f -S y n i nD R G(F=5 9.1 6 4,5 5.6 8 1;P0.0 1).C o m p a r e dw i t ht h eA 5 3 Tm i c ea g e d6m o n t h s,t h eA 5 3 Tm i c ea g e d1 2m o n t h sh a da s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f -S y n i nD R G(F=1 3.8 0 2,P0.0 5).C o n c l u s i o n A 5 3 Tm i c eh a v e ah i g h e re x p r e s s i o n l e v e l o f -S y n i nD R Gt h a nWTm i c ew i t ht h es a m ea g e i nm o n t h s,a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f-S y ni n c r e a s e sw i t ha g e.K E Y WO R D S a l p h a-s y n u c l e i n;P a r k i n s o nd i s e a s e;m i c e,t r a n s g e n i c;g a n g l i a,s p i n a l 帕金森病(P D)是一种主要影响运动功能的神经退行性疾病,其发病率随着年龄增加而逐渐上升1-3。目前,P D发生的确切原因和机制仍不完全清楚,但大量研究表明,基因突变是重要的因素之一4-7。A 5 3 T转基因(A 5 3 T)小鼠是一种常见的P D模型小鼠,其体内携带的人类A 5 3 T突变型-突触核蛋白(-S y n)基因可改变-S y n的结构,使原本可溶性的-S y n单体转变为不溶性的多聚体,可在动物体内重现由-S y n聚集起始的P D病理过程8-1 2。根据B R AAK学说可知,胃肠道可能是-S y n发生病变的起始部位1 3-1 6,且这些病理性-S y n会通过外周神经系统逐渐向中枢传播1 7。已有大量实验证实迷走神经在-S y n的肠-脑传播中承担主要作用,但是消化道与中枢之间还存在其他神经联络,如交感神经,其传入纤维的胞体主要汇聚在脊髓背根神经节(D R G)中。为明确D R G中是否也存在着-S y n高表达,本实验观察了不同月龄A 5 3 T小鼠D R G中-S y n的含量变化,从而为交感神经传入纤维参与-S y n从胃肠道传播至中枢的可能作用提供证据。现将结果报告如下。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 A 5 3 T小鼠(品系名称:B 6;C 3-T g(P r n p-S NC A*A 5 3 T)8 3 V l e/J),S P F级,购于南京大学模式动物研究所。小鼠饲养于清洁级动物房中,可自由进食饮水,饲养环境为光照模拟自然昼夜 节律,1 2h明暗交替,温度保持在2 02 4,相 3 3 8青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷对湿度保持在4 0%6 0%。选用6月龄和1 2月龄的纯合子A 5 3 T小鼠作为实验组,同窝相同月龄的野生型(WT)小鼠作为对照组。1.1.2 试剂 -S y n抗体、-t u b u l i n抗体购于美国C e l l S i g n a l i n gT e c h n o l o g y公司;山羊抗兔和山羊抗鼠抗体购 于 英 国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公 司;0.4 5mP V D F转印膜、E C L化学发光液均购于美国M i l l i p o r e公司:R I P A裂解液购于中国C o m W i nB i o t e c h公司。A 5 3 T小鼠基因型鉴定P C R试剂盒购于中国V a z y m e生物科技有限公司。1.2 实验方法1.2.1 A 5 3 T小鼠基因鉴定 A 5 3 T纯合子小鼠由A 5 3 T杂合子小鼠配种育得,饲养至1月龄进行分笼和鉴定。于尾尖部截取0.5c m长鼠尾组织提取D NA,按照试剂盒(T a qP r oH SU+P r o b eM a s t e rM i x,V a z y m e生物科技有限公司)说明配制实时荧光定量P C R反应体系并进行实验。根据P C R数据计算C t值,通过比较实验组与对照组纯合子目的基因的C t值,确定基因型。1.2.2 蛋白免疫印迹法检测D R G中-S y n表达小鼠经乌拉坦腹腔麻醉处死后取出脊柱,于体视显微镜下取出胸段、腰段和荐段的D R G组织放入E P管中,先用剪刀将组织剪碎,再加入配制好的R I P A裂解液,充分磨碎组织。冰上静置裂解3 0m i n后,应用高速离心机在4 下以1 20 0 0r/m i n离 心2 0m i n,吸取上清液转移至新的1.5m LE P管中,利用B C A试剂盒和酶标仪进行蛋白质定量,计算上样量。按比例加入l o a d i n gb u f f e r,充分混匀,1 0 0煮沸1 0m i n使蛋白充分变性,-2 0 冻存。蛋白样品 经S D S-P AG E电 泳(9 0 V、3 0 m i n,1 2 0 V、6 0m i n)分离后,湿法转至孔径为0.4 5m的P V D F膜上,按蛋白M a r k e r将目标蛋白裁剪出来,经脱脂奶粉 封 闭、一 抗 孵 育、HR P-I g G二 抗 孵 育 后,用T B S T缓冲液洗净,将膜与E C L超敏发光液反应后置于凝胶成像系统内进行观察并拍摄图像。采用I m a g eJ分析软件对蛋白条带进行灰度计算,目的蛋白表达水平以-S y n和-t u b u l i n g条带灰度值的比值表示。1.3 统计学处理应用S P S S2 5.0软件进行统计学处理。小鼠D R G中-S y n的表达量以xs表示,不同月龄WT和A 5 3 T